3-D打印支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：脊髓損傷（spinalcordinjury，SCI）是一種高致殘率、后果嚴(yán)重的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來(lái)隨著交通業(yè)、建筑業(yè)的不斷發(fā)展，脊髓損傷的發(fā)病率也在不斷上升。脊髓損傷造成的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能障礙往往是永久性的，給患者和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。因此對(duì)脊髓損傷的研究和治療是醫(yī)學(xué)界迫切要解決的一項(xiàng)重點(diǎn)難題，神經(jīng)科學(xué)界一直在探索各種方法來(lái)提高SCI的治療效果。大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)組織工程學(xué)在SCI治療中有著廣闊的應(yīng)用前景，組織工

2、程學(xué)治療SCI的基本模式是生物支架+種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用3-D打印機(jī)制備仿生支架，研究神經(jīng)分化因子1（neuronaldifferentiation1，NeuroD1）過(guò)表達(dá)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcells，NSCs）生存和分化的影響，探討3-D仿生支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)的療效。
　　方法：
　　1、取孕14d的SD（SpragueDawley）大鼠，麻醉消毒后分離胎鼠大腦海馬組織

3、，研磨并胰酶消化后離心，計(jì)數(shù)后分瓶培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況。當(dāng)神經(jīng)球直徑100-150μm時(shí)，胰酶消化后計(jì)數(shù)傳代培養(yǎng)。取第三代神經(jīng)干細(xì)胞行Nestin和DAPI免疫熒光染色鑒定其純度。將第三代神經(jīng)干細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后種植于預(yù)鋪多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)板中，7d后行MAP2、GFAP、MBP免疫熒光染色鑒定其分化潛能。取孕14dSD大鼠的胎鼠腦皮質(zhì)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)行NSCs的鑒定和分化研究。
　　2、攜帶NeuroD1基因

4、的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞，并研究其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞生存和分化的影響。
　　3、制備硫酸肝素-膠原蛋白水凝膠，采用3-D打印仿生脊髓支架，掃描電鏡觀察其結(jié)構(gòu)，測(cè)量孔隙率，并模擬體液體外降解實(shí)驗(yàn)測(cè)量pH值和質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)分為2組，A組取仿生脊髓支架體外與NSCs共培養(yǎng)，B組直接將細(xì)胞懸液接種于預(yù)涂左旋多聚賴(lài)氨酸的24孔培養(yǎng)板上。采用光鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞黏附與形態(tài)變化，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，免疫熒光染色鑒定NSCs的分化情況。
　　

5、4、3-D打印支架載NeuroD1修飾的神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)分四組，分別為對(duì)照組，支架組，支架+NSCs-GFP組，支架+NSCs-NeuroD1組。于1w、2w、4w、6w、8w分別進(jìn)行在體和離體實(shí)驗(yàn)評(píng)估：功能學(xué)恢復(fù)評(píng)估和形態(tài)學(xué)恢復(fù)評(píng)估。
　　結(jié)果：
　　1、顯微鏡下可見(jiàn)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，增殖迅速，7d左右可形成直徑150μm左右的神經(jīng)球，細(xì)胞透光度好。第三代神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色，Nestin和D

6、API雙標(biāo)率95％以上。分化鑒定試驗(yàn)可見(jiàn)MAP2、GFAP和MBP陽(yáng)性細(xì)胞，可與DAPI雙標(biāo)。
　　2、熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)綠光，GFP轉(zhuǎn)染成功。PCR結(jié)果顯示NeuroD1mRNA在NSCs-NeuroD1組表達(dá)最高，與其它兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。PCR結(jié)果顯示MAP2mRNA在NSCs-NeuroD1組表達(dá)最高，與其它兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。NSCs-NeuroD1組與其它兩組相比，神經(jīng)元突起長(zhǎng)度明顯增

7、加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。MTT結(jié)果顯示NSCs-NeuroD1組細(xì)胞增殖水平與其它兩組相比有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　3、3-D打印機(jī)成功制備出膠原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架，掃描電鏡顯示內(nèi)部具有縱行排列、平行的微孔結(jié)構(gòu)，通過(guò)排水法計(jì)算孔隙率為90%；體外降解實(shí)驗(yàn)中，支架pH值未發(fā)生明顯變化，8周左右支架降解完全，符合組織工程支架要求。MTT檢測(cè)示兩組培養(yǎng)1、3、7dA值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

8、<0.05）；光鏡觀察兩組均可見(jiàn)大量神經(jīng)球分化，神經(jīng)纖維交織成網(wǎng)狀；培養(yǎng)7dA組掃描電鏡觀察示細(xì)胞黏附于支架上，大量細(xì)胞伸出軸突，并且有神經(jīng)球形成；免疫熒光染色示，兩組均可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，定量分析顯示A和B組分化率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、支架+NSCs-NeuroD1組各時(shí)間段BBB評(píng)分最高，與其它三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。第八周，Tarlov和Rivlin評(píng)分，支架+NSCs-NeuroD1評(píng)

9、分最高，與其它三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。神經(jīng)電生理結(jié)果表明，支架+NSCs-NeuroD1組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)潛伏期最短與其它三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；支架+NSCs-NeuroD1組運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)振幅最大，與其它三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。免疫熒光染色結(jié)果表明，八周時(shí)支架+NSCs-NeuroD1組可見(jiàn)GFP陽(yáng)性細(xì)胞，部分分化為神經(jīng)元，與支架+NSCs-GFP組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：

10、
　　1、成功建立胚胎SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，細(xì)胞狀態(tài)好、純度高。神經(jīng)干細(xì)胞有多樣分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和退變性疾病的細(xì)胞替代治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2、過(guò)表達(dá)NeuroD1可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，能使分化神經(jīng)元突起長(zhǎng)度增加，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。
　　3、仿生3-D膠原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性，能促進(jìn)NSCs增殖和分化，