重組信號(hào)蛋白14-3-3和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在日本血吸蟲病免疫診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：從本實(shí)驗(yàn)室保種的重組質(zhì)粒pBK-CMV-SjGST中擴(kuò)增出日本血吸蟲(中國大陸株)26kDa谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(SjGST)編碼基因，克隆至表達(dá)載體pET28a(+)；分別誘導(dǎo)表達(dá)本實(shí)驗(yàn)室保種的含有日本血吸蟲信號(hào)蛋白14-3-3(Sj14-3-3)編碼基因的重組表達(dá)載體pET28a(+)-Sj14-3-3和構(gòu)建的重組表達(dá)載體pET28a(+)-SjGST；制備并分別純化出重組蛋白Sj14-3-3和SjGST；將兩者聯(lián)合應(yīng)用，建立

2、重組抗原間接ELISA方法(rSj-ELISA)診斷日本血吸蟲病。棋盤滴定法確定最適抗原包被量和血清稀釋度，用于急、慢性血吸蟲病診斷，并與成蟲粗抗原(SjAWA)的間接ELISA，以及間接血凝試驗(yàn)(IHA)和環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(COPT)平行檢測(cè)，比較幾種方法的敏感性和特異性之間的差異。同時(shí)比較3種方法在華支睪吸蟲和鉤蟲感染者之間的交叉反應(yīng)性，以探討重組抗原用于診斷血吸蟲病的實(shí)用性和可靠性。 方法：提取含SjGST編碼基因的重組質(zhì)粒p

3、BK-CMV-SjGST，PCR擴(kuò)增出目的片斷，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體pET28a(+)，誘導(dǎo)表達(dá)出rSjGST；同時(shí)誘導(dǎo)含Sj14-3-3編碼基因的重組質(zhì)粒pET28a(+)-Sj14-3-3表達(dá)出rSj14-3-3。SDS-PAGE和Westernblotting驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性，并分別用親和層析法純化重組蛋白，并用Bradford法檢測(cè)二者的含量。將rSj14-3-3和rSjGST按1：1比例聯(lián)合應(yīng)用包被反應(yīng)板，棋盤滴定確定

4、最適抗原包被量和血清稀釋度，建立rSj-ELISA診斷日本血吸蟲病方法，并分析板間差異和板內(nèi)差異，逐步優(yōu)化該方法。按確立的方法檢測(cè)糞檢蟲卵陽性的急、慢性血吸蟲病患者血清，并用SjAWA間接ELISA檢測(cè)上述血清，比較重組抗原與SjAWA敏感性和特異性的差異性；再用IHA和COPT檢測(cè)上述血清，比較不同方法之間敏感性和特異性；同時(shí)用rSj-ELISA和SEA-IHA、COPT檢測(cè)華支睪吸蟲和鉤蟲感染者血清，比較rSj-ELISA和SEA-

5、IHA及COPT三種方法的交叉反應(yīng)性。此外，用以上三種方法檢測(cè)流行區(qū)糞檢陰性者的血清，分析其隱性感染情況。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增出670bp大小的SjGST的DNA片斷，成功地將其克隆至pET28a(+)；將重組質(zhì)粒pET28a(+)-SjGST作BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，得到一條大小約670bp與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致的插入片斷；測(cè)序證實(shí)具有完整的ORF，且無有意義的突變。分別誘導(dǎo)表達(dá)上述質(zhì)粒和本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒pET28a(+

6、)-Sj14-3-3，證實(shí)構(gòu)建的和保種的兩種質(zhì)粒均能表達(dá)；Ni2+親和層析法分別純化出rSj14-3-3和rSjGST，SDS-PAGE檢測(cè)其分子量與理論值一致；Westernblotting顯示rSj14-3-3和rSjGST能夠分別被其特異性單克隆抗體識(shí)別。以rSj14-3-3和rSjGST聯(lián)合應(yīng)用作為抗原，經(jīng)過條件優(yōu)化進(jìn)行ELISA檢測(cè)，陰性閾值OD450nm為0.05，從而建立了rSj-ELISA診斷日本血吸蟲病的方法。rSj-

7、ELISA用于檢測(cè)急、慢性血吸蟲病患者血清，與SjAWA的ELISA比較，結(jié)果顯示：用兩種抗原檢測(cè)急性患者血清51例，陽性率分別為98.0％和96.1％，敏感性無顯著性差異(p＞0.900)；用兩種抗原檢測(cè)慢性患者血清49例，陽性率分別為91.8％和90.0％，敏感性也無顯著性差異(p＞0.500)；兩種抗原對(duì)于93例正常對(duì)照者血清檢測(cè)的假陽性率分別為2.2％和7.5％，也無顯著性差異(p＞0.050)。用rSj-ELISA和SEA-I

8、HA比較，檢測(cè)急、慢性血吸蟲病患者血清和正常對(duì)照者血清。結(jié)果顯示，兩法檢測(cè)急性患者血清128例，陽性率分別為89.1％和92.2％(p＞0.900)；檢測(cè)慢性患者血清112例，陽性率分別為50.0％和58.9％(p＞0.900)；正常對(duì)照者血清93例，假陽性率分別為2.2％和3.2％(p＞0.900)；兩種方法對(duì)上述三種血清檢測(cè)的敏感性均無顯著性差異。rSj-ELISA與COPT比較：rSj-ELISA檢測(cè)128例急性患者血清的陽性率為

9、89.1％，而COPT為80.5％，二者敏感性(檢出率)有顯著性差異(p＜0.050)；檢測(cè)112例慢性患者血清，rSj-ELISA的陽性率為50.0％，而COPT為14.3％，二者敏感性亦有顯著性差異(p＜0.005)；統(tǒng)計(jì)分析表明，rSj-ELISA無論對(duì)于急性還是慢性患者血清檢測(cè)的敏感性均顯著高于COPT；而兩種方法檢測(cè)正常對(duì)照者血清的假陽性率分別為2.2％和0％，差異無顯著性(p＞0.050)。華支睪吸蟲和鉤蟲交叉反應(yīng)性分析：r

10、Sj-ELISA和SEA-IHA比較，檢測(cè)華支睪吸蟲感染者血清的交叉反應(yīng)性分別為15.1％和17.0％，差異無顯著性(p＞0.500)；檢測(cè)鉤蟲感染者血清的交叉反應(yīng)性分別為14.6％和15.9％，差異也無顯著性(p＞0.900)。統(tǒng)計(jì)分析表明兩種方法對(duì)于華支睪吸蟲和鉤蟲的交叉反應(yīng)性相似。rSj-ELISA與COPT比較，檢測(cè)華支睪吸蟲感染者血清的交叉反應(yīng)性分別為15.1％和0％，有顯著性差異(p＜0.005)，檢測(cè)鉤蟲感染者血清的交叉反

11、應(yīng)性分別為14.6％和4.9％，差異也有顯著性(p＜0.025)，提示COPT雖然在急、慢性血吸蟲病診斷種的敏感性較差，但特異性很高。對(duì)于流行區(qū)糞檢蟲卵陰性者144例血清的檢測(cè)結(jié)果，rSj-ELISA陽性率為26.4％，SEA-IHA為47.8％，COPT為0.7％，經(jīng)分析，rSj-ELISA的陽性率低于SEA-IHA(p＜0.005)，而明顯高于COPT(p＜0.005)。流行區(qū)糞檢陰性者rSj-ELISA血清檢測(cè)陽性率明顯低于非流行

12、區(qū)正常對(duì)照者(2.2％)檢測(cè)的結(jié)果(χ2=23.66，p＜0.005)。 結(jié)論：本研究成功擴(kuò)增克隆了SjGST基因，并表達(dá)純化了兩種rSj14-3-3和rSjGST抗原；以此兩種重組抗原聯(lián)合應(yīng)用建立rSj-ELISA方法，探討了其敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性，結(jié)果表明rSi14-3-3和rSjGST用于日本血吸蟲病免疫診斷和SjAWA的ELISA，以及SEA-IHA具有相似的敏感性和特異性；rSj-ELISA和SEA-IHA的敏感