一、人CD59分子聯(lián)合ILY在小鼠體內(nèi)特異性清除靶細(xì)胞方法的建立及其應(yīng)用二、3-甲基腺嘌呤對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的抑制作用及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 人CD59分子聯(lián)合ILY在小鼠體內(nèi)特異性清除靶細(xì)胞方法的建立及其應(yīng)用
　　目的:
　　1.制備LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠），并通過與細(xì)胞特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+小鼠）雜交，獲得細(xì)胞特異性表達(dá)hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+ihCD59+小鼠）。
　　2.通過注射ILY在生理?xiàng)l件下和不同疾病模型中檢測(cè)其對(duì)小鼠體內(nèi)多種靶細(xì)胞的清除效

2、果，研究其在細(xì)胞再生、修復(fù)和疾病研究中的應(yīng)用。
　　方法:
　　一、LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和細(xì)胞特異性表達(dá)人CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　（一）Lox-Stop-Lox-hCD59重組表達(dá)載體的構(gòu)建
　　1.制備Cre條件性表達(dá)hCD59載體
　　2.體外驗(yàn)證pCAG-LSL-hCD59載體的Cre依賴性
　　在NIH3T3細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體和Cre重組

3、酶表達(dá)載體(Cre+)或者單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體（Cre-），轉(zhuǎn)染48小時(shí)后用hCD59熒光染色檢測(cè)細(xì)胞表面hCD59分子表達(dá)情況。
　　（二）LSL-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠）的制備
　　利用TARGATT技術(shù)，把CAG-LSL-hCD59的載體序列和體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA混合物通過TARGATTTM技術(shù)顯微注射入80個(gè)FVB遺傳背景的受精卵前核中，然后這些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠體

4、內(nèi)。通過TARGATTTM載體上的attB位點(diǎn)和染色體上的attP位點(diǎn)之間的遺傳重組，轉(zhuǎn)基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位點(diǎn)。顯微注射后共得到了23只子代小鼠，利用PCR檢測(cè)小鼠基因組DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。
　?。ㄈ┫到y(tǒng)表達(dá)Cre和hCD59雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1.獲得系統(tǒng)表達(dá)hCD59的Meox2Cre+ ihCD59+小鼠
　　2.檢測(cè)Meox2Cre++hCD59+小鼠體

5、內(nèi)hCD59在各個(gè)器官的表達(dá)
　?。ㄋ模┒喾N細(xì)胞特異性表達(dá)Cre和hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1.T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　2.肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系的制備
　　3.星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1)制備有hCD59表達(dá)的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠:用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+小鼠

6、雜交，通過基因鑒定得到hCD59表達(dá)的mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠。
　　2)檢驗(yàn)hCD59在星型膠質(zhì)細(xì)胞中的特異表達(dá):對(duì)mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠的腦冰凍切片進(jìn)行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色，確定hCD59在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特異表達(dá)。
　　二、ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除方法在生理和病理?xiàng)l件下的應(yīng)用
　?。ㄒ唬㊣LY的制備及活力測(cè)定和藥理學(xué)特性的測(cè)定
　　1.ILY的表

7、達(dá)、純化及活性檢測(cè)
　　2.檢測(cè)ILY的藥理學(xué)特征
　　3.檢測(cè)膽固醇對(duì)ILY作用的影響
　　（二）在生理狀態(tài)下ILY對(duì)靶細(xì)胞的清除
　　1.生理狀態(tài)下ILY對(duì)免疫系統(tǒng)靶細(xì)胞的清除
　　2.生理狀態(tài)下ILY對(duì)實(shí)質(zhì)器官中細(xì)胞的清除及細(xì)胞清除后再生的影響
　?。ㄈ㊣LY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除在研究病理機(jī)制方面的應(yīng)用
　　1.免疫細(xì)胞清除與急性肝損傷
　　2.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)

8、胞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的影響
　　3.清除星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的影響
　　結(jié)果:
　　一、獲得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠）
　　通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動(dòng)子及兩端有LoxP位點(diǎn)的STOP終止元件(LSL)下游，得到pCAG-LSL-hCD59載體;利用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體的NIH3T3細(xì)胞僅在共轉(zhuǎn)染Cre

9、重組酶表達(dá)載體的情況下，細(xì)胞膜表面有hCD59表達(dá);通過Applied Stem Cell Inc.公司的TARGATTTM定點(diǎn)敲入技術(shù)，把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因組的Hipp11(H11)位點(diǎn)，獲得Cre誘導(dǎo)性表達(dá)的Lox-Stop-Lox-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre induciblehCD59 mice，ihCD59小鼠)。在獲得的23只子代小鼠中，通過PCR方法驗(yàn)證hCD59是否整合入小鼠的基因

10、組DNA中。檢測(cè)后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得說明的是，ihCD59小鼠為+/+純合子小鼠。
　　二、獲得系統(tǒng)和多種細(xì)胞特異性表達(dá)Cre和hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+ihCD59+小鼠）
　?。ㄒ唬┇@得系統(tǒng)表達(dá)hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠
　　通過將ihCD59小鼠和系統(tǒng)表達(dá)Cre重組酶的Meox2Cre+小鼠雜交，并對(duì)子代小鼠進(jìn)行基因鑒定，得到有hCD59

11、表達(dá)的Meox2Cre+ ihCD59+小鼠和沒有hCD59表達(dá)的Meox2Cre-ihCD59+小鼠（雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子）。
　　通過流式細(xì)胞分析術(shù)和免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的所有器官均有表達(dá)，而未表達(dá)于Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6野生型小鼠中。說明通過ihCD59小鼠和Cre陽性小鼠雜交來獲得hCD59表達(dá)陽性的子代小鼠是可行的;ihCD59

12、小鼠的誘導(dǎo)性hCD59表達(dá)在各個(gè)器官中非常均一。同時(shí)，hCD59在子代小鼠體內(nèi)的表達(dá)嚴(yán)格受到Cre的調(diào)控。
　?。ǘ┇@得多種細(xì)胞特異性表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　1.獲得T細(xì)胞、髓系細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　2.獲得肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系
　　3.獲得星形膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　三、ILY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除方法在

13、生理和病理?xiàng)l件下的應(yīng)用
　?。ㄒ唬㊣LY的制備及活力測(cè)定和藥理學(xué)特性測(cè)定
　?。ǘ┰谏頎顟B(tài)下ILY對(duì)靶細(xì)胞的清除
　　1.生理狀態(tài)下ILY對(duì)免疫系統(tǒng)靶細(xì)胞的清除
　　2.生理狀態(tài)下ILY對(duì)實(shí)質(zhì)器官中細(xì)胞的清除及細(xì)胞再生的影響
　?。ㄈ㊣LY/ihCD59介導(dǎo)的靶細(xì)胞清除在多種疾病模型中的應(yīng)用
　　1.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)急性肝損傷的影響
　　2.清除T細(xì)胞、B細(xì)胞和髓系細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)

14、性自身免疫性腦脊髓炎的影響
　　3.清除星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的影響
　　結(jié)論:
　　1.ihCD59/ILY介導(dǎo)的細(xì)胞清除方法可以特異、快速地清除體內(nèi)靶細(xì)胞
　　本研究成功建立了Cre條件性表達(dá)hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠），通過與不同品系的細(xì)胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，使hCD59特異表達(dá)在子代小鼠的靶細(xì)胞中。對(duì)子代小鼠進(jìn)行ILY注射可以實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的體內(nèi)清除。肝臟細(xì)胞和膽管上皮細(xì)

15、胞清除模型實(shí)驗(yàn)顯示，ILY可以特異的在短時(shí)間內(nèi)分別清除肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，而沒有引起任何非目標(biāo)效應(yīng)。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)ILY/ihCD59介導(dǎo)的細(xì)胞清除存在ILY劑量依賴性。
　　2.ihCD59/ILY介導(dǎo)的細(xì)胞清除方法可以被用于研究不同細(xì)胞在生理和疾病狀態(tài)下的功能
　　ILY單次注射和多次注射可以引起短期的和長(zhǎng)期的靶細(xì)胞清除，成為研究細(xì)胞再生以及細(xì)胞在急性疾病模型（如急性肝損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部創(chuàng)傷）或慢性病理過程（如E

16、AE）中功能的有力手段。
　　3.ILY具有很大的使用劑量范圍
　　我們的實(shí)驗(yàn)表明比清除細(xì)胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對(duì)小鼠都是安全有效的，不會(huì)引起任何非靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)生物體也不存在毒副作用。
　　第二部分 3-甲基腺嘌呤對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的抑制作用及相關(guān)機(jī)制
　　目的:
　　一、研究小鼠體內(nèi)3-MA應(yīng)用對(duì)高脂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化的影響;
　　二、探索3-MA影響動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的

17、可能機(jī)制(抑制自噬或促進(jìn)自噬或有其他作用)。
　　方法：
　　一、研究3-A在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用
　　(一)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的誘導(dǎo)和3-MA干預(yù)。
　　(二)檢測(cè)3-MA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的影響。
　　二、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機(jī)制
　　(一)檢測(cè)3-MA在高脂環(huán)境對(duì)自噬的影響。
　　(二)檢測(cè)3-MA對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化和存活的影響。
　　(三)檢測(cè)3-MA

18、對(duì)斑塊局部細(xì)胞因子的影響。
　　結(jié)果：
　　一、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并促進(jìn)了斑塊的穩(wěn)定性，但另一個(gè)自噬抑制劑LY294002無作用。
　　二、研究3-MA抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　一、3-MA對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有顯著地抑制作用。
　　二、3-MA促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。
　　三、3-MA通過增強(qiáng)自噬水平，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化并促進(jìn)其死亡。