一、人CD59分子聯(lián)合ILY在小鼠體內(nèi)特異性清除靶細胞方法的建立及其應(yīng)用二、3-甲基腺嘌呤對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的抑制作用及相關(guān)機制.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 人CD59分子聯(lián)合ILY在小鼠體內(nèi)特異性清除靶細胞方法的建立及其應(yīng)用
　　目的:
　　1.制備LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠），并通過與細胞特異性表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+小鼠）雜交，獲得細胞特異性表達hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+ihCD59+小鼠）。
　　2.通過注射ILY在生理條件下和不同疾病模型中檢測其對小鼠體內(nèi)多種靶細胞的清除效

2、果，研究其在細胞再生、修復和疾病研究中的應(yīng)用。
　　方法:
　　一、LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和細胞特異性表達人CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　?。ㄒ唬㎜ox-Stop-Lox-hCD59重組表達載體的構(gòu)建
　　1.制備Cre條件性表達hCD59載體
　　2.體外驗證pCAG-LSL-hCD59載體的Cre依賴性
　　在NIH3T3細胞中共轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體和Cre重組

3、酶表達載體(Cre+)或者單獨轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體（Cre-），轉(zhuǎn)染48小時后用hCD59熒光染色檢測細胞表面hCD59分子表達情況。
　?。ǘ㎜SL-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠）的制備
　　利用TARGATT技術(shù)，把CAG-LSL-hCD59的載體序列和體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA混合物通過TARGATTTM技術(shù)顯微注射入80個FVB遺傳背景的受精卵前核中，然后這些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠體

4、內(nèi)。通過TARGATTTM載體上的attB位點和染色體上的attP位點之間的遺傳重組，轉(zhuǎn)基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位點。顯微注射后共得到了23只子代小鼠，利用PCR檢測小鼠基因組DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。
　?。ㄈ┫到y(tǒng)表達Cre和hCD59雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1.獲得系統(tǒng)表達hCD59的Meox2Cre+ ihCD59+小鼠
　　2.檢測Meox2Cre++hCD59+小鼠體

5、內(nèi)hCD59在各個器官的表達
　?。ㄋ模┒喾N細胞特異性表達Cre和hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1.T細胞、髓系細胞和樹突狀細胞特異表達hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　2.肝臟細胞和膽管上皮細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系的制備
　　3.星形膠質(zhì)細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
　　1)制備有hCD59表達的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠:用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+小鼠

6、雜交，通過基因鑒定得到hCD59表達的mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠。
　　2)檢驗hCD59在星型膠質(zhì)細胞中的特異表達:對mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠的腦冰凍切片進行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色，確定hCD59在星形膠質(zhì)細胞中的特異表達。
　　二、ILY/ihCD59介導的靶細胞清除方法在生理和病理條件下的應(yīng)用
　?。ㄒ唬㊣LY的制備及活力測定和藥理學特性的測定
　　1.ILY的表

7、達、純化及活性檢測
　　2.檢測ILY的藥理學特征
　　3.檢測膽固醇對ILY作用的影響
　　（二）在生理狀態(tài)下ILY對靶細胞的清除
　　1.生理狀態(tài)下ILY對免疫系統(tǒng)靶細胞的清除
　　2.生理狀態(tài)下ILY對實質(zhì)器官中細胞的清除及細胞清除后再生的影響
　?。ㄈ㊣LY/ihCD59介導的靶細胞清除在研究病理機制方面的應(yīng)用
　　1.免疫細胞清除與急性肝損傷
　　2.清除T細胞、B細胞和髓系細

8、胞對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的影響
　　3.清除星形膠質(zhì)細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復的影響
　　結(jié)果:
　　一、獲得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠）
　　通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動子及兩端有LoxP位點的STOP終止元件(LSL)下游，得到pCAG-LSL-hCD59載體;利用體外實驗證實，轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體的NIH3T3細胞僅在共轉(zhuǎn)染Cre

9、重組酶表達載體的情況下，細胞膜表面有hCD59表達;通過Applied Stem Cell Inc.公司的TARGATTTM定點敲入技術(shù)，把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因組的Hipp11(H11)位點，獲得Cre誘導性表達的Lox-Stop-Lox-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre induciblehCD59 mice，ihCD59小鼠)。在獲得的23只子代小鼠中，通過PCR方法驗證hCD59是否整合入小鼠的基因

10、組DNA中。檢測后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得說明的是，ihCD59小鼠為+/+純合子小鼠。
　　二、獲得系統(tǒng)和多種細胞特異性表達Cre和hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠（Cre+ihCD59+小鼠）
　?。ㄒ唬┇@得系統(tǒng)表達hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠
　　通過將ihCD59小鼠和系統(tǒng)表達Cre重組酶的Meox2Cre+小鼠雜交，并對子代小鼠進行基因鑒定，得到有hCD59

11、表達的Meox2Cre+ ihCD59+小鼠和沒有hCD59表達的Meox2Cre-ihCD59+小鼠（雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子）。
　　通過流式細胞分析術(shù)和免疫組織化學染色，發(fā)現(xiàn)hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的所有器官均有表達，而未表達于Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6野生型小鼠中。說明通過ihCD59小鼠和Cre陽性小鼠雜交來獲得hCD59表達陽性的子代小鼠是可行的;ihCD59

12、小鼠的誘導性hCD59表達在各個器官中非常均一。同時，hCD59在子代小鼠體內(nèi)的表達嚴格受到Cre的調(diào)控。
　　（二）獲得多種細胞特異性表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　1.獲得T細胞、髓系細胞和樹突狀細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　2.獲得肝臟細胞和膽管上皮細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系
　　3.獲得星形膠質(zhì)細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠
　　三、ILY/ihCD59介導的靶細胞清除方法在

13、生理和病理條件下的應(yīng)用
　　（一）ILY的制備及活力測定和藥理學特性測定
　?。ǘ┰谏頎顟B(tài)下ILY對靶細胞的清除
　　1.生理狀態(tài)下ILY對免疫系統(tǒng)靶細胞的清除
　　2.生理狀態(tài)下ILY對實質(zhì)器官中細胞的清除及細胞再生的影響
　?。ㄈ㊣LY/ihCD59介導的靶細胞清除在多種疾病模型中的應(yīng)用
　　1.清除T細胞、B細胞和髓系細胞對急性肝損傷的影響
　　2.清除T細胞、B細胞和髓系細胞對實驗

14、性自身免疫性腦脊髓炎的影響
　　3.清除星形膠質(zhì)細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復的影響
　　結(jié)論:
　　1.ihCD59/ILY介導的細胞清除方法可以特異、快速地清除體內(nèi)靶細胞
　　本研究成功建立了Cre條件性表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠（ihCD59小鼠），通過與不同品系的細胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，使hCD59特異表達在子代小鼠的靶細胞中。對子代小鼠進行ILY注射可以實現(xiàn)對靶細胞的體內(nèi)清除。肝臟細胞和膽管上皮細

15、胞清除模型實驗顯示，ILY可以特異的在短時間內(nèi)分別清除肝細胞和膽管細胞，而沒有引起任何非目標效應(yīng)。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)ILY/ihCD59介導的細胞清除存在ILY劑量依賴性。
　　2.ihCD59/ILY介導的細胞清除方法可以被用于研究不同細胞在生理和疾病狀態(tài)下的功能
　　ILY單次注射和多次注射可以引起短期的和長期的靶細胞清除，成為研究細胞再生以及細胞在急性疾病模型（如急性肝損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部創(chuàng)傷）或慢性病理過程（如E

16、AE）中功能的有力手段。
　　3.ILY具有很大的使用劑量范圍
　　我們的實驗表明比清除細胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對小鼠都是安全有效的，不會引起任何非靶細胞殺傷效應(yīng)，對實驗生物體也不存在毒副作用。
　　第二部分 3-甲基腺嘌呤對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的抑制作用及相關(guān)機制
　　目的:
　　一、研究小鼠體內(nèi)3-MA應(yīng)用對高脂誘導的動脈粥樣硬化的影響;
　　二、探索3-MA影響動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的

17、可能機制(抑制自噬或促進自噬或有其他作用)。
　　方法：
　　一、研究3-A在動脈粥樣硬化中的作用
　　(一)動脈粥樣硬化斑塊的誘導和3-MA干預。
　　(二)檢測3-MA對動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的影響。
　　二、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機制
　　(一)檢測3-MA在高脂環(huán)境對自噬的影響。
　　(二)檢測3-MA對巨噬細胞泡沫化和存活的影響。
　　(三)檢測3-MA

18、對斑塊局部細胞因子的影響。
　　結(jié)果：
　　一、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成并促進了斑塊的穩(wěn)定性，但另一個自噬抑制劑LY294002無作用。
　　二、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機制。
　　結(jié)論：
　　一、3-MA對動脈粥樣硬化有顯著地抑制作用。
　　二、3-MA促進了動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。
　　三、3-MA通過增強自噬水平，抑制巨噬細胞泡沫化并促進其死亡。