酶育牛黃對apoE---小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響及其機制研究.pdf

1、目的
　　探討酶育牛黃(calculus bovis cultivated by glucuronidase，CBCG)對載脂蛋白E基因敲除(apoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響，闡明CBCG對血漿和動脈炎癥和氧化應激水平的作用。
　　方法
　　40只7-8周齡雄性apoE-/-小鼠，隨機分為4組，分別為對照組（酶育牛黃溶媒灌胃組，n=10）、CBCG低、中、高劑量治療組(0.25 g/kg·d、0.75 g

2、/kg·d、2.25 g/kg·d，n=10)。適應性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)灌胃8周，同時給予高脂(15.8％)高膽固醇(1.25％)飲食，自由飲水。灌胃8周末，禁食12小時，麻醉，小鼠內(nèi)眥靜脈取血，取材。解剖分離主動脈全長，包埋心底制備主動根部連續(xù)冰凍切片，油紅O染色主動脈全長和主動脈根部，檢測粥樣斑塊脂質(zhì)含量，計算斑塊面積;Elisa檢測血漿炎癥因子IL-6和TNF-α水平，分光光度計法檢測血漿丙二醛(MDA)和對氧磷酯酶-1(PON1)

3、水平;Elisa測定CBCG血漿活性成分膽紅素(Bilirubin)和?；撬?Taurine)水平;免疫熒光化學方法檢測主動脈瓣部位巨噬細胞標志分子（MOMA-2）、血管細胞粘附分子（VCAM-1）、細胞間粘附分子(ICAM-1)和α腫瘤壞死因子(TNF-α)，4羥基壬烯醛(HNE)，磷酸化Janus酪氨酸激酶(P-JAK2)及信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子1(P-STAT1)表達水平。動物實驗最后，酶法測定血漿總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽

4、固醇(HDL-C)水平;肝、腎臟制作石蠟切片，HE染色，進一步了解CBCG長期灌胃給藥的安全性。細胞實驗，體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細胞，ox-LDL(100μg/ml)刺激巨噬細胞，CBCG(溶解于DMSO)直接干預細胞，Elisa方法檢測細胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-6和IFN-γ水平;western blot檢測JAK2/STAT1/SOCS1信號通路蛋白表達。
　　相同周齡雄性C57BL/6J小鼠41只，隨機分3組對照組(酶

5、育牛黃溶媒灌胃組，n=14)、CBCG高、中劑量治療組(2.25g/kg·d，n=14;0.75g/kg·d，n=13)。同樣給予高脂飼料，連續(xù)灌胃12周后，禁食12h，麻醉，小鼠內(nèi)眥靜脈取血，通過超速離心法獲得低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL3)。通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(RCT)功能實驗檢測HDL對巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇溢出的影響;通過HDL對Cu2+誘導LDL氧化程度的保護作用，檢測HDL的抗氧化功能;通過MTT比色法

6、檢測內(nèi)皮細胞存活實驗，檢測HDL抗內(nèi)皮細胞凋亡功能;通過單核細胞粘附實驗檢測HDL保護內(nèi)皮細胞的功能。
　　結(jié)果
　　與對照組組相比，油紅O染色結(jié)果顯示CGCB治療組顯著抑制主動脈根部和全長主動脈的動脈粥樣斑塊形成;血漿Elisa檢測血漿IL-6，TNF-α水平顯著降低;血漿氧化生物指標丙二醛(MDA)顯著降低，對氧磷酯酶-1(PON1)顯著升高;CBCG血漿有效成分檢測結(jié)果顯示，CBCG高劑量治療組血漿中膽紅素水平顯著高于

7、對照組，血漿牛磺酸呈水平升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。主動脈根部免疫熒光結(jié)果表明，CBCG可抑制炎癥指標粘附分子VCAM-1、ICAM-1和TNF-α的表達，減少血管壁巨噬細胞浸潤;CBCG可抑制炎癥通路JAK2/STAT1通路蛋白磷酸化;CBCG可抑制氧化指標HNE表達，降低脂質(zhì)氧化程度;血漿生化檢測顯示，CBCG治療組總膽固醇(TC)和非高密度脂蛋白膽固醇(non-HDL-C)水平變化無統(tǒng)計學意義，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水

8、平顯著升高;肝腎HE染色未見明顯異常。細胞實驗，CBCG可顯著抑制ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞產(chǎn)生的IL-6，IFN-γ水平，抑制JAK2和STAT的磷酸化，下調(diào)SOCS1水平。另外，CBCG可顯著改善C57BL/6J小鼠血漿HDL功能，主要表現(xiàn)在促進巨噬細胞內(nèi)[3H]標記膽固醇的溢出;抑制Cu2+誘導的LDL氧化作用;抑制單核細胞粘附作用和內(nèi)皮細胞保護作用。
　　結(jié)論
　　1.CBCG抑制apoE-/-小鼠動脈

9、粥樣硬化斑塊的形成;
　　2.CBCG抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成可能與改善血漿炎癥和氧化應激水平有關(guān);
　　3.CBCG抑制apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成可能與減輕斑塊部位炎癥和氧化應激程度有關(guān);
　　4.CBCG對抗apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的炎癥機理可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT1/SOCS1信號通路有關(guān);
　　5.CBCG改善C57BL/6J小鼠HDL的功能，包括促進膽固醇溢出、抗