LncRNA-RNCR2對(duì)糖尿病視神經(jīng)病變的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的:
　　探究長(zhǎng)鏈非編碼RNA-RNCR2在糖尿病性視神經(jīng)病變過程中的調(diào)控作用及作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、首先通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)構(gòu)建大鼠糖尿病模型，實(shí)驗(yàn)分為四組:正常SD大鼠、4 W STZ-SD大鼠、8 W STZ-SD大鼠和12WSTZ-SD大鼠，qRT-PCR檢測(cè)各組視網(wǎng)膜中RNCR2的表達(dá)水平;構(gòu)建視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cell，RGC)

2、和Müller細(xì)胞的高糖損傷模型，實(shí)驗(yàn)分四組:正常濃度葡萄糖（5 mmol/L）、高濃度葡萄糖(30 mmol/L)24h、高濃度葡萄糖(30 mmol/L)48 h和高濃度葡萄糖（30 mmol/L）72 h，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中RNCR2的表達(dá)水平。
　　2、通過腹腔注射STZ構(gòu)建大鼠糖尿病模型，實(shí)驗(yàn)分為四組:正常SD大鼠、12 W STZ-SD大鼠、敲除RNCR2的12 W STZ-SD大鼠、敲除Scr-siRNA的

3、12WSTZ-SD大鼠，采用免疫熒光檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞蛋白標(biāo)記物GFAP、GS，RGC蛋白標(biāo)記物Neun、TUBB3，雙極細(xì)胞:PKC-α、水平細(xì)胞:Calbindin和無長(zhǎng)突細(xì)胞:Calretinin的表達(dá)情況。
　　3、利用高濃度葡萄糖(30 mmol/L)構(gòu)建RGC、Müller細(xì)胞高糖模型，實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組、高糖刺激組、下調(diào)Scr-siRNA的高糖刺激組、下調(diào)RNCR2的高糖刺激組。利用200μmol/

4、L H2O2構(gòu)建RGC、Müller細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，實(shí)驗(yàn)分四組:對(duì)照組、H2O2刺激組、下調(diào)Scr-siRNA的H2O2刺激組、下調(diào)RNCR2的H2O2刺激組。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的活力;采用Hoechst染色、JC-1染色和PI/Calcein-AM染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡和死亡情況;采用細(xì)胞免疫熒光染色Ki-67檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。
　　4、機(jī)制研究:通過Western blots技術(shù)檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)

5、、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和重組人神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)在大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、在大鼠視網(wǎng)膜組織、RGC細(xì)胞和Müller細(xì)胞中均有RNCR2表達(dá)，且隨著STZ-SD大鼠、RGC細(xì)胞和Müller細(xì)胞在高糖環(huán)境下時(shí)間的延長(zhǎng)，RNCR2的表達(dá)逐漸增加。
　　2、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中NeuN和TUBB3表達(dá)下降，GFAP和GS表達(dá)增加;下調(diào)RNCR2后NeuN、TUBB3表達(dá)進(jìn)一步下降，GFAP和

6、GS表達(dá)下降;PKC-α、Calbindin和Calretinin的表達(dá)無顯著變化。
　　3、RGC和Müller細(xì)胞給予高糖或H2O2刺激后，細(xì)胞活力和增殖能力均下降，細(xì)胞死亡和凋亡數(shù)量增加;下調(diào)兩種細(xì)胞RNCR2的表達(dá)并給予高糖或H2O2刺激后，細(xì)胞活力和增殖能力進(jìn)一步下降，細(xì)胞死亡和凋亡數(shù)量進(jìn)一步增加。
　　4、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中BDNF、NT-3和NGF表達(dá)增加，敲除RNCR2后BDNF、NT-3和NGF表達(dá)明顯