乙型肝炎病毒X蛋白通過CDC42蛋白誘發(fā)Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化的機制研究.pdf

1、肝細胞癌是世界第五大流行癌癥，致死率非常高。慢性乙型肝炎病毒(HepatitisB virus，HBV)感染被認為是誘發(fā)肝癌的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)HBV基因組X基因編碼的X蛋白(hepatitsis B virus X protein，HBx)在HBV復制和誘發(fā)肝癌過程中具有重要作用。課題組前期對HBx轉(zhuǎn)基因小鼠SILAC（Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture）定

2、量蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，在HBx誘發(fā)小鼠肝臟由重度炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y過程中，CDC42信號通路相關分子及CDC42蛋白本身蛋白表達量上調(diào)，提示在HBx誘發(fā)小鼠肝癌過程中，CDC42信號通路被激活。激活的CDC42可參與多條信號通路，引起細胞骨架、細胞周期、細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力等改變。為了解CDC42蛋白是否參與以及如何參與HBx介導的Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化，本研究首先通過CRISPR/Cas9技術對Huh7-HBx細胞中的CDC42基因進行修飾，而

3、后通過添加CDC42特異性抑制劑CASIN抑制Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞中CDC42活性，探究CDC42功能破壞時HBx介導的Huh7惡性轉(zhuǎn)化程度變化，進而揭示CDC42在HBx誘發(fā)人肝細胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用。研究結果將為深入理解HBV致癌機制、尋找HBV相關肝癌的治療靶標提供理論依據(jù)。
　　具體研究結果如下:
　　1.HBx介導Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化
　　為了解HBx基因的異常表達是否可引起人肝癌細胞系

4、Huh7細胞系的惡性轉(zhuǎn)化，首先應用實時定量PCR檢測Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞中HBx基因表達情況，采用CCK-8試劑盒檢測2種細胞的增殖能力、Annex V和FITC試劑盒檢測細胞凋亡水平，并通過細胞劃痕實驗檢測HBx基因轉(zhuǎn)染前后Huh7細胞遷移能力的變化情況。結果顯示:(1)Huh7-HBx細胞中HBx基因的表達顯著高于Huh7-mock細胞(p＜0.01);(2) Huh7-HBx細胞的增殖能力顯著高于Huh7-

5、mock細胞(p＜0.01);(3)Huh7-HBx細胞的抗凋亡能力顯著高于Huh7-mock細胞（流式細胞儀分析）。(4) Huh7-HBx細胞的遷移能力高于Huh7-mock細胞;(5)與Huh7-mock細胞相比，Huh7-HBx細胞中CDC42蛋白表達量升高(Western blot分析)。
　　2.HBx介導Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化依賴CDC42
　　為了驗證CDC42蛋白是否參與HBx介導的Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化，首先

6、應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對Huh7-HBx細胞中CDC42基因進行編輯，檢測CDC42基因敲除前后細胞的增殖能力、凋亡水平及遷移能力，而后采用CDC42蛋白特異性抑制劑CASIN處理Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞，了解其對細胞增殖及凋亡水平的影響。結果發(fā)現(xiàn):(1)獲得在CDC42基因第二外顯子處具有4個堿基缺失的突變體細胞(Huh7-HBx CDC42KO);(2) Huh7-HBx CDC42 KO細胞增殖能力顯著

7、低于Huh7-HBx細胞(p＜0.01);(3) Huh7-HBx CDC42 KO細胞群體中晚期凋亡細胞比例升高，即細胞抗凋亡能力顯著下降;(4) Huh7-HBx CDC42 KO細胞的遷移能力低于Huh7-HBx細胞;(5)不同濃度CASIN處理一定時間后，Huh7-HBx細胞的增殖能力顯著降低(p＜0.01)，而Huh7細胞的增殖能力沒有顯著變化;Huh7-HBx細胞的抗凋亡能力顯著下降(p＜0.01)，而Huh7細胞抗凋亡能力

8、在抑制劑處理前后沒有顯著變化。
　　3.CDC42參與HBx介導Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化的定量蛋白質(zhì)組研究
　　為了鑒定參與HBx介導Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化的CDC42蛋白下游效應因子，利用基于質(zhì)量虧損的準等重二甲基標記技術分別對Huh7-mock細胞和Huh7-HBx細胞的全蛋白在肽段水平進行化學標記，混合后的肽段經(jīng)離線液相分離，Q Exactive HF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜檢測，pFind3.0搜索引擎處理數(shù)據(jù)。結果顯示:(1)在H

9、uh7-HBx(30L)和Huh7-HBx CDC42 KO(30H)組數(shù)據(jù)中，共定量到4436個蛋白，其中差異蛋白為523個，上調(diào)蛋白為239個，下調(diào)蛋白共284個;(2)下調(diào)蛋白的功能主要聚集在細胞死亡、細胞凋亡等途徑;(3) IQGAP1蛋白作為CDC42的下游效應因子可能參與了HBx介導的Huh7細胞惡性轉(zhuǎn)化。
　　以上研究結果表明，HBx進入Huh7細胞后，通過調(diào)控CDC42蛋白活性，使其與IQGAP1結合，導致Huh7