乙型肝炎病毒X蛋白介導(dǎo)microRNA在原發(fā)性肝癌中的機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)數(shù)百萬(wàn)HCC患者合并有乙型肝炎病毒(HBV)的感染，而HBV患者發(fā)生HCC的幾率比非HBV患者高100倍，乙型肝炎病毒(HBV)感染被認(rèn)為是HCC發(fā)生最主要的原因。乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)由HBV編碼，在HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中具有重要作用，但由于很少有理想的動(dòng)物模型來(lái)論證HBx在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用，因此HBx在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制并不完全清楚。

2、幸運(yùn)的是，p21-HBx轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)建立起來(lái)，它是通過(guò)同源重組和干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將HBx基因插入p21基因的第二外顯子區(qū)域而建立的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。據(jù)報(bào)道該模型的p21-/-小鼠在2年以上的時(shí)間沒(méi)有一只小鼠發(fā)生腫瘤，提示該模型小鼠的p21缺失不會(huì)增加小鼠發(fā)生HCC腫瘤的易感性。并且，HBx基因受PGK啟動(dòng)子(強(qiáng)啟動(dòng)子)的調(diào)控，因此，HBx蛋白能在該模型中的肝臟持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)24個(gè)月以上，并且60％的該轉(zhuǎn)基因小鼠在18個(gè)月左右能發(fā)展HCC，

3、有些甚至發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，這現(xiàn)象與人類感染HBV后發(fā)展成HCC的病史相似。因此，p21-HBx轉(zhuǎn)基因小鼠為我們研究HBx致HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中可能的機(jī)制提供了理想的動(dòng)物模型。 MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21-23個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA，在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤發(fā)生。最近研究顯示miRNA在多種腫瘤中的表達(dá)水平發(fā)生了變化，可能在某些腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。研究認(rèn)為

4、miRNA水平的變化常導(dǎo)致其靶基因的表達(dá)異常，從而影響了腫瘤的進(jìn)程。許多腫瘤都涉及到了miRNA的變化，并且其變化程度還與腫瘤的分型分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)，這提示我們miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮了重要作用，其表達(dá)的模式可作為腫瘤診斷/預(yù)后的分子標(biāo)記。但現(xiàn)在很少有文獻(xiàn)系統(tǒng)的研究與HBx特異相關(guān)的miRNA在HBx導(dǎo)致的HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中的作用。 目前普遍認(rèn)為HBx是病毒反式作用因子，它通過(guò)與宿主的轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、AP

5、-2、NF-κB、ATF2、CREB等)結(jié)合而發(fā)揮其生理功能，這種結(jié)合可以發(fā)生在宿主DNA的任何區(qū)域，從而導(dǎo)致宿主基因的不穩(wěn)定性，而基因的這種不穩(wěn)定性如果發(fā)生在原癌基因、抑癌基因或者miRNA基因等部位，就會(huì)改變這些基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。這就提示了，雖然目前一些已知的基因和蛋白能提供很多有用的信息，但是對(duì)miRNA研究的新發(fā)現(xiàn)也能為我們理解HBx致HCC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新視角。因此，發(fā)現(xiàn)一個(gè)或一組與HBx特異相關(guān)的mi

6、RNA對(duì)我們具有重要意義，它能讓我們更好的理解HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，做到早期診斷，改善治療干預(yù)手段，防止HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，提高肝癌患者的存活率。 基于上述發(fā)現(xiàn)，展開(kāi)研究，利用real-time PCR技術(shù)對(duì)p21-HBx轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠肝臟的miRNA進(jìn)行了表達(dá)水平分析，功能分析，并在HCC患者標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，初步探討了與HBx功能相關(guān)的miRNAs在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠肝

7、臟中有7個(gè)miRNA的表達(dá)水平發(fā)生變化，其中，5個(gè)上調(diào)的miRNA(miR-212，miR-23a，miR-155，miR-17-5p和miR-20a)，2個(gè)下調(diào)的miRNA(miR-152和miR-200a)，它們的變化趨勢(shì)隨著腫瘤的發(fā)展而表現(xiàn)的更為明顯。隨后，利用HBx敲入(將pEGFP-HBx轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞)和敲出(用adr HBx干擾HepG2.2.15細(xì)胞中HBx的表達(dá))的細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，篩選出的這7個(gè)特異性miR3qA的表

8、達(dá)水平與HBx的表達(dá)水平密切相關(guān)，它們呈劑量依賴關(guān)系。體外功能實(shí)驗(yàn)證明它們能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞侵襲的潛能，并可能在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用：過(guò)表達(dá)的miR-212，miR-23a，miR-155，miR-17-5p和miR-20a能抑制細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)的miR-152和miR-200a則能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；過(guò)表達(dá)的miR-212，miR-17-5p和miR-20a能促進(jìn)細(xì)胞增殖，而過(guò)表達(dá)的miR-200a則能抑制細(xì)胞增殖；另外，

9、過(guò)表達(dá)的miR-212，miR-23a，miR-17-5p和miR-20a能顯著增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移的潛能；而過(guò)表達(dá)的miR-152和miR-200a則明顯抑制了細(xì)胞侵襲和遷移的潛能，這些miRNAs的表達(dá)模式均在HCC患者標(biāo)本中得以驗(yàn)證。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這組miRNA參與了HBx介導(dǎo)的HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程，因此可能是HBV相關(guān)HCC的標(biāo)志物。 同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-143在10月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟(正常，未發(fā)現(xiàn)病變)中的表達(dá)

10、水平明顯降低，而在22月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟(發(fā)生HCC)中的表達(dá)水平明顯上升，尤其是那些伴隨肺轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因小鼠，上調(diào)水平更明顯，接著，HBV相關(guān)HCC患者標(biāo)本中miR-143的表達(dá)模式也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果：miR-143在HBV相關(guān)HCC標(biāo)本中顯著上調(diào)，尤其是具有轉(zhuǎn)移特點(diǎn)的HBV相關(guān)HCC標(biāo)本中顯著上調(diào)。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-143并不能影響細(xì)胞的增殖和凋亡，卻能顯著提高細(xì)胞的侵襲能力，并且其促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移的能力是通過(guò)HBx調(diào)控

11、途徑而實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步用軟件分析和CHIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB可以直接結(jié)合到人mir-143基因上游的5kb左右位點(diǎn)，并且直接調(diào)控miR-143的表達(dá)。隨后，利用TargetScan分析軟件和熒光素報(bào)告酶系統(tǒng)篩選出其下游靶基因?yàn)镕NDC3B(fibronectin typeⅢ domain containing3B)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證明，受NF-κB調(diào)控的miR-143通過(guò)下調(diào)靶基因FNDC3B，從而參與了由HBx介導(dǎo)的HCC腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程，這