乙型肝炎病毒X蛋白通過上調(diào)Capn4表達促進肝癌細胞遷移的研究.pdf

1、背景:
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染與肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生發(fā)展之間具有十分密切的關(guān)系,其中乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)發(fā)揮著極其重要的作用。既往實驗研究發(fā)現(xiàn),HBx在誘導肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中具有參與反式激活與信號轉(zhuǎn)導、調(diào)節(jié)細胞凋亡與增殖、促進癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移等多種生物學功能。但HBx促進

2、肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機制依然尚未完全清楚。近期研究發(fā)現(xiàn),鈣蛋白酶小亞基(Calpain small subunit1,Capn4)在肝細胞癌肝移植術(shù)后復發(fā)組織及轉(zhuǎn)移灶中為高表達,提示Capn4在肝癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。因此,有必要進一步研究HBx與Capn4之間的關(guān)系和相互作用機制。
　　目的:
　　本實驗以人肝癌細胞系HepG2和H7402為研究對象,通過瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV X基因,檢測HBx在肝癌

3、細胞中對Capn4表達的影響,觀察Capn4在HBx促進肝癌細胞遷移過程中的作用,探討HBx調(diào)節(jié)Capn4的分子機制,從而闡明HBx促進肝癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的新的分子機制,并為臨床治療HBV感染性肝細胞癌的轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過在HepG2和H7402細胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV X基因,建立穩(wěn)定表達HBx的細胞系模型HepG2-X和H7402-X,并應用報告基因、Real-time PCR和Western b

4、lot三種實驗手段,分別檢測Capn4在HepG2(H7402)與HepG2-X(H7402-X)細胞系中的表達差異;同時,應用小RNA干擾(siRNA)技術(shù)沉默HBx在HepG2-X(H7402-X)中的表達,觀察Capn4表達量的變化。
　　2、在HepG2和H7402細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染HBV X基因,并通過報告基因、Real-time PCR和Western blot三種實驗手段檢測轉(zhuǎn)染24小時后細胞內(nèi)Capn4表達量的變化。

5、
　　3、以人肝癌細胞系HepG2為模型,通過單層細胞傷痕修復實驗檢測Capn4在HBx促進的肝癌細胞遷移過程中的作用。
　　4、應用生物信息學軟件分析Capn4的啟動子序列,發(fā)現(xiàn)其中存在核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的潛在結(jié)合位點。應用siRNA和特異性化學抑制劑,在HepG2-X和H7402-X細胞中對NF-κB進行沉默和抑制,再應用報告基因和Western blot兩種實驗手段檢測細胞中C

6、apn4表達量的變化。以單堿基點突變技術(shù)將Capn4啟動子序列中的潛在的NF-κB結(jié)合位點進行突變,并應用報告基因檢測HBx對突變型Capn4啟動子的激活情況。
　　結(jié)果:
　　1、在HepG2-X(H7402-X)細胞系中,Capn4的表達在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均明顯高于其在HepG2(H7402)細胞系中的表達。同時,針對HBx的siRNA可抑制Capn4的表達。
　　2、瞬時轉(zhuǎn)染HBV X基因24小時后,HepG2

7、和H7402細胞中的Capn4表達量在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均有明顯上升。
　　3、穩(wěn)定表達HBx的人肝癌細胞HepG2-X的遷移能力明顯高于未表達HBx的HepG2細胞,而針對HBV X基因的siRNA可顯著降低HepG2-X的遷移能力。在HepG2-X細胞中應用siRNA沉默Capn4的表達后, HepG2-X的遷移能力也顯著降低。
　　4、在HepG2-X和H7402-X細胞中,通過對NF-κB進行沉默和抑制,Capn4的