臭氧自體血回輸對(duì)急性腦缺血神經(jīng)保護(hù)作用的影響的相關(guān)研究.pdf

1、目的:
　　1.通過功能評(píng)分、Hoechst染色、免疫組織化學(xué)、免疫印跡及氧自由基生化檢測(cè)等方法，初步探討臭氧自體血回輸對(duì)大鼠腦缺血急性期運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)、缺血腦組織凋亡及氧自由基損傷的影響。
　　2.采用NIHSS評(píng)分及MEP的方法評(píng)估，明確臭氧自體血回輸對(duì)急性腦梗死患者臨床運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響。
　　方法:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分
　　1.1建立臭氧自體血回輸治療大鼠MACO模型及分組
　　選取3月齡25

2、0-280g雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，使用線栓法建立MACO模型，給予隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組、缺血對(duì)照組及缺血治療組，每組18只。缺血治療組在術(shù)后12h取大鼠尾源靜脈血2 ml置于回輸專用注射器中，與預(yù)先設(shè)定的臭氧濃度（47μg/ml）按1∶1的比例混合5-10分鐘后，將血液經(jīng)尾源靜脈回輸，每12小時(shí)一次，治療6次。
　　1.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分
　　在術(shù)后12h及第6次臭氧自體血回輸治療12小時(shí)后，通過Lo

3、nga法進(jìn)行神經(jīng)行為評(píng)分。
　　1.3凋亡檢測(cè)
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，處死大鼠后取材，通過Hoechst染色、Tunel染色、免疫組織化學(xué)及免疫印跡的方法，分別檢測(cè)缺血皮層的凋亡情況，同時(shí)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-2在缺血腦組織的表達(dá)情況。
　　1.4氧自由基的檢測(cè)
　　神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后，處死大鼠后取材，使用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)缺血腦組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase

4、，SOD)、丙二醛(malonaldehyde， MDA)的含量。
　　2.臨床試驗(yàn)部分
　　2.1研究對(duì)象:試驗(yàn)納入急性腦梗死患者86例（男58例，女28例），隨機(jī)分為對(duì)照組43例及臭氧治療組43例。兩組基礎(chǔ)用藥均為拜阿司匹林腸溶片0.3g1/晚+阿托伐他汀鈣片20mg，1/晚，臭氧治療組除藥物及康復(fù)治療外給予臭氧自體血回輸治療，1/日，10天一療程;對(duì)照組僅給予藥物及康復(fù)治療。
　　2.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn):
　　

5、2.2.1入組標(biāo)準(zhǔn):①年齡在30～80歲之間;②CT或磁共振檢查排除腦出血、TIA以及由腦腫瘤、腦外傷、腦寄生蟲病、代謝障礙等引起的卒中患者，證實(shí)為急性腦梗死患者;③入院后予NIHSS評(píng)分，分?jǐn)?shù)在4～20分之間;④發(fā)病時(shí)間小于72小時(shí)大于6小時(shí)以上且不能進(jìn)行靜脈溶栓及動(dòng)脈取栓的患者。
　　2.2.2排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重卒中患者，例如多腦葉梗死（CT低密度影大于1/3大腦半球）;②已進(jìn)行溶栓治療的患者;③休克、生命體征不平穩(wěn)、嚴(yán)重心肺并

6、發(fā)癥及肝腎功能不全患者或預(yù)期壽命不超過1個(gè)月的;④凝血機(jī)能障礙或血小板量及功能異常的患者，地中海貧血、鐮狀細(xì)胞性貧血患者，葡萄糖—6—磷酸脫氫酶缺乏癥即蠶豆病患者;⑤癥狀未控制的甲狀腺功能亢進(jìn);⑥高敏體質(zhì);⑦使用激酶類藥物、抗自由基制劑的患者;⑧妊娠期或哺乳期婦女;⑨因不適合行MEP檢查者:既往安裝起搏器及有癲癇病史患者。⑩依從性差，不能遵囑完成相關(guān)檢查、治療、記錄的患者。
　　2.3檢測(cè)方法:
　　2.3.1臨床功能評(píng)分。

7、
　　2.3.2氧自由基檢測(cè)。
　　2.3.3 MEP檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分
　　給予線栓法制作的MCAO大鼠，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均在1～3分。
　　1.2凋亡檢測(cè)
　　1.2.1 Hoechst染色:觀察治療3天后的各組缺血皮層細(xì)胞的Hoechst染色，可以看到大量的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白。
　　1.2.2 Tunel

8、染色:觀察治療3天后的各組缺血皮層細(xì)胞的染色，熒光下可看到大量細(xì)胞，體積縮小，呈三角形或扇形，細(xì)胞核固縮深染。
　　1.2.3凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè):
　　1)免疫組織化學(xué)染色:顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax、Caspase-2的陽性細(xì)胞染色均以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，也有部分胞膜及核膜著色。
　　2) Western Blot蛋白電泳及灰度值檢測(cè)
　　Western Blot蛋白電泳及灰度

9、值檢測(cè)后，缺血治療組Bcl-2/Bax比值較缺血對(duì)照組明顯增高(P＜0.01)
　　1.3氧自由基檢測(cè)
　　1.3.1缺血腦組織SOD活力水平測(cè)定:治療后，假手術(shù)組、缺血對(duì)照組、缺血治療組血漿SOD活力值分別是（5.10±0.78）U/mg.prot，（1.62±0.53）U/mg.prot，（3.26±0.58）U/mg.prot，缺血治療組、缺血對(duì)照組較假手術(shù)組下降，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），缺血對(duì)照組較缺血治

10、療組明顯下降(P＜0.01)。
　　1.3.2缺血腦組織MDA活力水平測(cè)定:假手術(shù)組、缺血對(duì)照組、缺血治療組血漿MDA值分別是（0.45±0.11）nmol/mg.prot，（1.55±0.29）nmol/mg.prot，（0.79±0.16）nmol/mg.prot，缺血治療組、缺血對(duì)照組較假手術(shù)組增高，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，缺血對(duì)照組較缺血治療組明顯增高(P＜0.05)。
　　2.臨床試驗(yàn)結(jié)果
　　2

11、.1急性腦梗死患者的臨床功能評(píng)分
　　治療前兩組患者NIHSS評(píng)分間差異無顯著性意義(P＞0.05)。治療10d后，臭氧治療組與對(duì)照組患者NIHSS評(píng)分均較治療前明顯下降（P＜0.05），臭氧治療組較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05);臭氧治療組患者臨床總有效率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2.2氧自由基相關(guān)指標(biāo)檢測(cè):
　　2.2.1血清NO水平測(cè)定:治療前，臭氧治療組及對(duì)照組NO含量分別為(67.30±10.71

12、)μmol/l，（65.74±11.97）μmol/l，治療10天后，臭氧治療組及對(duì)照組NO含量分別為（48.12±10.59）μmol/l，（53.95±11.55）μmol/l。治療前，臭氧治療組及對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);治療后臭氧治療組及對(duì)照組NO含量均較治療前明顯增高(P＜0.01)，但臭氧治療組較對(duì)照組明顯降低，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2.2血清SOD水平測(cè)定:治療前，臭氧治療

13、組及對(duì)照組SOD含量分別為(80.52±6.29) U/ml，(82.02±6.34) U/ml，治療10天后，臭氧治療組及對(duì)照組SOD含量分別為(96.80±8.73) U/ml及對(duì)照組SOD(90.45±9.54) U/ml。治療前，臭氧治療組及對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);治療后，臭氧治療組及對(duì)照組SOD含量均較治療前明顯增高(P＜0.01)，但臭氧治療組較對(duì)照組明顯升高，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

14、>　　2.2.3血清MDA水平測(cè)定:治療前，臭氧治療組及對(duì)照組MDA含量分別為（9.63±3.98）nmol/ml，（9.58±3.55）nmol/ml，治療10天后，臭氧治療組及對(duì)照組MDA含量分別為(7.32±3.78)nmol/ml，對(duì)照組(6.11±3.60)nmol/ml。治療前，臭氧治療組及對(duì)照組比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);治療后，臭氧治療組及對(duì)照組MDA含量均較治療前明顯下降(P＜0.01)，但比較對(duì)照組，臭氧治

15、療組MDA含量明顯下降，兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　2.3臭氧自體血回輸治療急性腦梗死患者神經(jīng)功能及運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位相關(guān)研究
　　2.3.1臭氧治療后急性腦梗死患者受試者臨床總有效率變化:治療前兩組患者NIHSS評(píng)分差異無顯著性意義(P＞0.05）。治療10天后，臭氧治療組與對(duì)照組患者NIHSS評(píng)分較治療前相比明顯減少(P＜0.05)，臭氧治療組少于對(duì)照組(P＜0.05);臭氧治療組患者臨床總有效率明顯高于對(duì)照組

16、(P＜0.05)。
　　2.3.2皮層電位引出率比較:運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位顯示治療前，臭氧治療組及對(duì)照組皮層電位引出率無顯著性差異(P＞0.05)。在治療10天后，臭氧治療組及對(duì)照組上肢及下肢皮層電位引出人數(shù)均較治療前增多，但皮層電位引出人數(shù)但臭氧治療組與對(duì)照組比較無明顯增高(P＞0.05)，臭氧治療組上肢皮層電位引出率較對(duì)照組明顯增高，下肢皮層電位引出率與對(duì)照組比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.臭氧自體血

17、回輸治療大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞可有效改善其神經(jīng)功能評(píng)分;臭氧自體血回輸治療腦缺血能夠抑制缺血皮層細(xì)胞的凋亡，對(duì)凋亡蛋白具有一定影響，通過調(diào)節(jié)缺血腦組織Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)蛋白，增加Bcl-2/Bax比值，而改善缺血后臨床神經(jīng)功能。我們認(rèn)為臭氧自體血回輸抑制缺血后凋亡與抑制皮層Caspase-2的相關(guān)凋亡程序有關(guān)。
　　2.臭氧自體血回輸治療急性腦缺血，可通過調(diào)節(jié)SOD、NO及MDA等水平抗自由基損傷用，提示臭氧自體血回輸可通過對(duì)