肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑-色苷酸二鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)病機(jī)制的調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　根據(jù)最新世界衛(wèi)生組織×WHO)報(bào)告，2015年全球瘧疾病例為2.14億，438，000人死于瘧疾感染，其中惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum）引起的腦型瘧疾(簡(jiǎn)稱(chēng)腦瘧，cerebral malaria，CM)是重癥患者致死的主要原因。CM患者從頭痛和全身不適發(fā)展到偏癱、共濟(jì)失調(diào)、昏迷甚至死亡非常迅速。人和鼠瘧的研究均表明腦瘧的發(fā)生常伴有腦部微血管紅細(xì)胞，血小板和白細(xì)胞的滯留以及前炎癥性細(xì)胞因子的過(guò)渡

2、表達(dá)。CD4+輔助性T細(xì)胞(CD4+Th1)和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD8+CTL)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)于誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性腦瘧(experimental cerebralmalaria，ECM)的發(fā)生至關(guān)重要。CD4+T細(xì)胞參與ECM免疫病理的誘導(dǎo)期，而CD8+T細(xì)胞在腦部血管中的滯留對(duì)于ECM發(fā)展起到致病性的效應(yīng)。
　　肥大細(xì)胞(mast cell，MC)是由骨髓多能造血干細(xì)胞分化而來(lái)，成熟的肥大細(xì)胞胞質(zhì)中含有大量具有生物活性的分

3、泌顆粒。當(dāng)肥大細(xì)胞被激活時(shí)，這些預(yù)制的顆粒成分被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。肥大細(xì)胞通過(guò)分泌顆?；衔锇l(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)功能。肥大細(xì)胞廣泛分布毛細(xì)血管及淋巴管周?chē)?duì)于肥大細(xì)胞的研究主要集中于過(guò)敏性疾病，但其分布特點(diǎn)提示著肥大細(xì)胞在機(jī)體中起著“哨兵”的作用，是戰(zhàn)斗在抵御病原體入侵的第一道防線(xiàn)。已知弓形蟲(chóng)等寄生蟲(chóng)感染時(shí)均可引起肥大細(xì)胞增多。然而，目前肥大細(xì)胞在瘧疾感染免疫的作用尚不明確，有限的研究結(jié)果尚存明顯的相悖之處。一方面，通過(guò)對(duì)比研究肥大細(xì)

4、胞基因缺陷鼠和正常鼠，證實(shí)肥大細(xì)胞及其來(lái)源的TNF在瘧疾感染的保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮主要作用;另一方面，瘧原蟲(chóng)抗原能夠誘導(dǎo)人類(lèi)肥大細(xì)胞系HMC-1或KU812分泌VEGF，通過(guò)導(dǎo)致血管異常而介導(dǎo)腦瘧的發(fā)生;小鼠肥大細(xì)胞來(lái)源的FIt3配體(FIt31)可以促進(jìn)CD8α+DCs形成，驅(qū)動(dòng)CD8+T細(xì)胞活化，從而影響瘧疾感染;組胺是肥大細(xì)胞脫顆粒產(chǎn)生的最重要的介質(zhì)，惡性瘧原蟲(chóng)感染時(shí)，會(huì)使血漿中中性氨基酸水平升高，引起組胺合成增加，引起相應(yīng)的神經(jīng)癥狀。

5、據(jù)報(bào)道，肥大細(xì)胞可調(diào)節(jié)血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。
　　色苷酸二鈉(disodium cromoglycate，DSCG)是一種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，早在60年代就以吸入給藥的方式用于治療慢性哮喘，具有抗炎活性。本實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠感染伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmudium.berghei ANKA，Pb ANKA)建立實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型，通過(guò)腹腔注射方式給予感染小鼠色甘

6、酸二鈉，探討其在腦瘧模型中的調(diào)控作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1、建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
　　6～8周齡，雌性C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射1×106 PbANKA寄生感染的紅細(xì)胞(PRBC)，建立CM鼠瘧模型。小鼠隨機(jī)分為四組，實(shí)驗(yàn)組小鼠于感染第0-5天連續(xù)腹腔給予色苷酸二鈉(10或100mg/kg)，對(duì)照組給予等量生理鹽水。監(jiān)測(cè)感染率、生存率。
　　2、血腦屏障通透性檢測(cè)
　　(1)將各組小鼠靜脈注射200μl

7、2％伊文思藍(lán)染料1h
　　(2)腹腔注射0.4ml4％的水合氯醛，進(jìn)行麻醉
　　(3)用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，至流出清亮液體為準(zhǔn)，然后取腦，拍照
　　(4)并將各組小鼠的腦放入離心管中，管內(nèi)加入1ml甲酰胺，37℃孵育48h
　　(5)將各管取出，3000rpm離心15min，取上清液200μl，至于96孔板中
　　(6)分光亮度計(jì)630nm檢測(cè)OD值
　　3、HE染色
　　腦組織切片標(biāo)本經(jīng)4％

8、多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，染色方法如下:
　　(1)石蠟切片脫蠟脫水
　　(2)蘇木素染色10-15min
　　(3)用自來(lái)水沖洗3min，然后1％鹽酸酒精分化5-10s
　　(4)用自來(lái)水沖洗15min反藍(lán)，然后伊紅染色3-5min
　　(5)用自來(lái)水沖洗3次，沖去浮色
　　(6)石蠟切片脫水透明
　　(7)用中性樹(shù)脂封片
　　4、腦組織組胺含量檢測(cè)
　　(1)

9、將腦組織加入1ml0.4 mol/L的HClO4，至于冰上勻漿后加入0.5ml H2O，混勻，15000rpm(30000Xg)15min4℃離心。
　　(2)吸取2.0ml上清液加入2.0ml水、0.25ml5mol/L NaOH，0.75g固體NaCl和5ml正丁醇。震搖5min將組胺抽提到正丁醇相。
　　(3)吸取2.0ml上清液加入2.0ml水、0.25ml5mol/L NaOH，0.75g固體NaCl和5ml正丁醇

10、。震搖5min將組胺抽提到正丁醇相。
　　(4)吸取丁醇相，并加入2.0ml0.1mol/L HCl和5ml的正庚烷，震搖1min后離心。組胺存在于水相中，用于熒光檢測(cè)。
　　(5)1ml標(biāo)準(zhǔn)液或待檢溶液轉(zhuǎn)移到試管中并加入0.4ml的1mol/L的NaOH，然后加入0.1ml1％ OPT-甲醇溶液，5min后加入0.2ml的3mol/L的HCl。然后將溶液轉(zhuǎn)移至比色杯中在360nm激發(fā)波長(zhǎng)和460nm檢測(cè)波長(zhǎng)下進(jìn)行熒光檢測(cè)。

11、
　　5、流式細(xì)胞術(shù)
　　(1)脾細(xì)胞熒光抗體染色:
　　無(wú)菌取出小鼠脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液。然后加入0.17 mol/L NH4Cl溶液裂解紅細(xì)胞。然后用含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640調(diào)整脾細(xì)胞終濃度為1×107/ml。每份樣品加入100ul脾細(xì)胞懸液，經(jīng)FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育、洗滌后，進(jìn)行熒光抗體染色，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和同種型對(duì)照。DCs檢測(cè):用抗CD11c-FITC、抗CD11b-PE、抗CD8α

12、-Percp和抗MHCⅡ-APC單克隆抗體進(jìn)行染色，4℃孵育30min，洗滌2遍后，用0.3ml細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。效應(yīng)性T細(xì)胞檢測(cè):用抗CD4-FITC、抗CD44-PE、抗CD8α-Percp和抗CD62L-APC單克隆抗體進(jìn)行染色，4℃孵育30min，洗滌2遍后，加入0.3ml細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　(2)腦組織流式細(xì)胞術(shù):
　　腦組織用150目篩網(wǎng)研磨，轉(zhuǎn)移研磨后腦組織懸

13、液至5ml含有100U/mlⅣ型膠原酶的RPMI1640中，42℃水浴45分鐘。然后經(jīng)300×g水平離心10min。棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入2ml40％ percoll重懸，混勻后加入到已加有2ml100％percoll的15ml的離心管中，2700rpm，水平離心30min，取中間層細(xì)胞，加入到15ml的EP管中，加PBS至10ml，1700rpm，離心6min，棄上清。計(jì)數(shù)細(xì)胞，并調(diào)細(xì)胞濃度至1×106/ml。取100ul腦細(xì)胞懸

14、液，經(jīng)FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體孵育、洗滌后，進(jìn)行熒光抗體染色，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和同種型對(duì)照。標(biāo)記的熒光抗體:FITC-CD4、PE-CD11b、PerCP-CD8、APC-Gr-1和APC-cy7-CD45。4℃染色30min，PBS洗滌細(xì)胞兩次，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　6、ELISA檢測(cè)
　　用ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清中IL-6和IFN-γ的分泌水平。酶標(biāo)儀用450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，結(jié)果以試劑

15、盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1Ls軟件分析，計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/ml)。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　使用Prism5.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，標(biāo)本采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或多個(gè)樣本one way ANOVA比較分析各組統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用Kaplan-Meyer方法進(jìn)行生存期分析。p＜0.05為顯著差異。
　　結(jié)果：
　　1、DSCG處理后對(duì)ECM小鼠的感染率和生存期的影響
　　C

16、57小鼠感染腹腔注射1×106 Pb ANKA寄生紅細(xì)胞(PRBC)后，于d3在外周血圖片中可見(jiàn)瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞(PRBCs)，隨后瘧原蟲(chóng)感染率緩慢上升并維持在較低水平(＜10％)，感染小鼠于d5-11死亡。腹腔10mg/kgDSCG給藥組小鼠的死亡時(shí)間與對(duì)照組(PbA)無(wú)明顯差異，而腹腔100mg/kg DSCG給藥組小鼠瘧原蟲(chóng)感染率逐漸升高，在感染后d17達(dá)到最高峰(～50％)，于d20死于貧血。
　　2.、DSCG處理顯著

17、改善腦組織的病理狀況
　　小鼠腦組織病理學(xué)檢查顯示，PbA+DSCG組顯微鏡下每個(gè)視野中白細(xì)胞沉積的血管數(shù)明顯低于對(duì)照組。同時(shí)，檢測(cè)了各組小鼠血腦屏障的通透性，發(fā)現(xiàn)給予DSCG后能明顯抑制ECM模型中的血腦屏障通透性破壞。除此之外，我們還檢測(cè)了腦組織中組胺的含量，發(fā)現(xiàn)DSCG給藥后組胺的含量也明顯降低。
　　3、DSCG處理顯著減少腦組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞百分率
　　在ECM模型中，CD4+T和CD8+T細(xì)胞

18、浸潤(rùn)與血腦屏障的通透性增加緊密相關(guān)。我們?cè)谛∈蟾腥竞骴5天取腦組織，研磨制備單細(xì)胞細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS檢測(cè)CD4+T、CD8+T細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例，觀察DSCG給藥對(duì)小鼠腦組織中浸潤(rùn)細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，DSCG給藥后腦組織CD8+T細(xì)胞的百分率顯著減少，CD4+T細(xì)胞也出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但中性粒細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。
　　4、DSCG給藥后降低血清中IL-6、IFN-γ和組胺的水平
　　小鼠感染后d5眼球取血后分離血清，ELIS

19、A檢測(cè)血清中IL-6和IFN-γ的水平，發(fā)現(xiàn)PbA+DSCG組小鼠血清中IL-6和IFN-γ的含量與對(duì)照組相比顯著下降。小鼠感染后d5眼球取血后分離血清，分別檢測(cè)各組血清組胺的含量。結(jié)果顯示PbA+DSCG組比對(duì)照組血清組胺的含量明顯減少。
　　5、DSCG處理可下調(diào)脾臟DCs的成熟與活化
　　在小鼠感染瘧原蟲(chóng)后d5，PbA組小鼠脾臟中髓樣DCs(CD11c+CD11b+)和CD8α+DC（CD8α+CD11c+）的比例顯著

20、高于PbA+DSCG組。此外表達(dá)抗原提呈分子MHCⅡ和協(xié)同刺激分子CD86分子的成熟DCs在PbA+DSCG組小鼠脾臟中的比例也顯著降低。由此可見(jiàn)，DSCG給藥后可抑制脾臟DCs成熟和活化。
　　6、DSCG處理降低脾臟效應(yīng)性T細(xì)胞比例和數(shù)量
　　經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)，我們檢測(cè)了小鼠感染瘧原蟲(chóng)后d5脾臟效應(yīng)性T細(xì)胞的比例和數(shù)量。與PbA組小鼠相比，PbA+DSCG組小鼠脾臟CD4+和CD8+的效應(yīng)性T細(xì)胞（CD44+CD62L-）的