孤獨(dú)癥相關(guān)基因NRXN2β的啟動(dòng)子識(shí)別及mRNA序列的5’UTR區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分研究48孔板邊緣效應(yīng)對(duì)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的影響
　　目的：
　　觀察48孔板的邊緣孔對(duì)熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果的影響。
　　方法：
　　用常規(guī)方法培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞HEK293，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000（Invitrogen公司）將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL4.13Z和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染入48孔板中的HEK293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h用熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性

2、，觀察邊緣孔的邊緣效應(yīng)對(duì)熒光素酶活性的影響，及內(nèi)參海腎熒光素酶校準(zhǔn)后的相對(duì)熒光素酶活性的影響，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)觀察此種差異是否由于細(xì)胞數(shù)目的不同所致。在此基礎(chǔ)上，尋找可能減小邊緣效應(yīng)的方法，如：細(xì)胞種植入48孔板時(shí)室溫靜置、48孔板重疊、空置邊緣孔。
　　結(jié)果：
　　使用48孔培養(yǎng)板進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)存在邊緣效應(yīng)，邊緣孔與中間孔的測(cè)定值有顯著的差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而邊緣效應(yīng)對(duì)細(xì)胞數(shù)目并沒(méi)有影響。細(xì)胞種植入

3、48孔板后，先室溫靜置1.5h、或重疊一個(gè)48孔板、或空置邊緣孔都不能減弱邊緣效應(yīng)；將48孔板的邊緣24個(gè)孔填充液體（1*PBS、ddH20、培養(yǎng)基），可以削弱邊緣效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)使用48孔板會(huì)發(fā)生邊緣效應(yīng)。48孔板邊緣24個(gè)孔填充相應(yīng)的液體可以削弱邊緣效應(yīng)。
　　第二部分孤獨(dú)癥相關(guān)基因NRXN2β的啟動(dòng)子識(shí)別及mRNA序列的5’UTR對(duì)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用
　　目的：
　　尋找

4、NRXN2β基因的啟動(dòng)子和探究5’UTR對(duì)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。
　　方法：
　　應(yīng)用生物信息學(xué)尋找NRXN2β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）及上游調(diào)控區(qū)域，設(shè)計(jì) PCR引物，以HEK293 DNA為模板，用DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和PGL4.10載體進(jìn)行雙酶切、鏈接，最終得到含有不同區(qū)域的NRXN2β基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將NRXN2β基因的熒光素酶報(bào)告

5、基因質(zhì)粒與內(nèi)參海腎熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收細(xì)胞。用雙熒光素酶檢測(cè)試劑（Promega）測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性并用內(nèi)參照進(jìn)行校準(zhǔn)，最終螢火蟲(chóng)熒光素酶活性（Fluc）/海腎熒光素酶活性（Rluc）的比值反映NRXN2β基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體的活性，比較不同報(bào)告基因載體間活性的差異,確定NRXN2β基因的啟動(dòng)子功能區(qū)域。將NRXN2β基因的5’UTR區(qū)插入載體pL4promoter的啟動(dòng)子后

6、面，從而研究5’UTR區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用，通過(guò)質(zhì)粒的刪切確定具體的功能區(qū)域。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建一系列含有不同啟動(dòng)子區(qū)域和不同5’UTR區(qū)域的NRXN2β基因熒光素酶報(bào)告基因載體，最長(zhǎng)插入片段2065bp,包含NRXN2β第一個(gè)外顯子上游1661到下游404的序列，即P4NRXN2β-1661/+404E。刪切分析發(fā)現(xiàn)-558/-184之間含有啟動(dòng)子區(qū)域。質(zhì)粒P4NRXN2β-558/+512E與P4NRXN2β