FABP4基因啟動子活性分析及同型半胱氨酸對其啟動活性的調(diào)控作用.pdf

1、目的：研究同型半胱氨酸對人源FABP4啟動子活性的影響及DNA甲基化調(diào)控的具體機制，以探索同型半胱氨酸致動脈粥樣硬化可能的治療靶點。
　　方法：本課題分別以HEK-293A細胞及人源誘導巨噬細胞為研究對象。應用生物信息學方法獲得并預測FABP4基因啟動子區(qū)順式轉(zhuǎn)錄作用元件和反式作用因子的結(jié)果，以pGL3-basic為工具載體采用基因重組法構(gòu)建啟動子截取片段，轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞觀察不同截取片段的熒光素酶活性變化并分析不同截取片

2、段的轉(zhuǎn)錄啟動活性功能。觀察不同濃度0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、500μmol/L的同型半胱氨酸及100μmol/L同型半胱氨酸+葉酸、VitB12和5-氮雜胞苷（AZC）干預腺病毒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄活性最強的FABP4基因啟動子截取片段中巨噬細胞熒光素酶活性變化。巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測FABP4啟動子甲基化水平。
　　結(jié)果：構(gòu)建好插入pGL3-basic重組載體的截

3、取片段轉(zhuǎn)染HEK-293A細胞后測得熒光素酶活性顯示，與空載體pGL3對照組相比較，-1000/-1片段組啟動活性沒有明顯改變；-500/-1片段組和-2000/-1片段組啟動活性明顯增加，它們轉(zhuǎn)錄活性分別約為空載體pGL3對照組的2.5倍（p<0.01）和3倍（p<0.01），而-2000/-1501片段組是空載體pGL3對照組的1.5倍（p<0.01），-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性最強；-2000/-1片段組轉(zhuǎn)錄活性約為-500/

4、-1片段組片段組的1.2倍（p<0.01）。對照載體pRL-TK所攜帶的啟動子是HSV1-TK基因自身啟動子,FABP4基因啟動子的啟動活性均在TK啟動活性的40％以下。
　　不同濃度Hcy作用FABP4基因啟動子（-2000/-1）后，與0μmol/L Hcy濃度組比較，50μmol/L Hcy濃度組啟動活性略有降低，500μmol/L Hcy濃度組啟動活性明顯降低，均無顯著性差異；100μmol/L Hcy濃度組和200μmo

5、l/L Hcy濃度組啟動活性明顯升高，100μmol/L Hcy濃度組約為0μmol/L Hcy濃度組和500μmol/L Hcy濃度組的3倍（p<0.01），約為50μmol/L Hcy濃度組的4倍（p<0.01）；與0μmol/L Hcy濃度組比較，用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑AZC作用后，F(xiàn)ABP4基因啟動活性增高3倍，差異有顯著性（p<0.01）；與100μmol/L Hcy濃度組比較，給予葉酸和VitB12干預后，啟動子啟動活性大約降

6、低10%，差異有顯著性（p<0.01）。
　　DNA甲基化狀態(tài)的改變可以影響基因的轉(zhuǎn)錄。FABP4基因DNA甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，100μmol/L Hcy組甲基化水平下降了大約45.4%，具有顯著性差異(P<0.05)；葉酸和VitB12干預后甲基化水平較100μmol/L Hcy上升55.5%，具有顯著性差異(P<0.05)；AZC組較0μmol/L Hcy組甲基化程度低約1.5倍，具有顯著性差異(P<0.05

7、)。mRNA的表達是基因轉(zhuǎn)錄的第一步，F(xiàn)ABP4的mRNA的表達狀態(tài)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，100μmol/L Hcy組mRNA的表達水平上升了大約5倍，具有顯著性差異(P<0.01)；葉酸和VitB12干預后mRNA的表達水平較100μmol/L Hcy下降9倍，具有顯著性差異(P<0.01)；AZC組較對照組mRNA的表達高6倍，具有顯著性差異(P<0.01)。蛋白的產(chǎn)生是基因表達關(guān)鍵的最終階段也是產(chǎn)生具有活性蛋白質(zhì)的第一階段，

8、FABP4蛋白表達檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，100μmol/L Hcy組蛋白產(chǎn)生水平上升了大約2倍，具有顯著性差異(P<0.05)；葉酸和VitB12干預后蛋白產(chǎn)生水平較100μmol/L Hcy下降約20%，具有顯著性差異(P<0.05)；AZC組較對照組組蛋白表達增加約15%，具有顯著性差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：FABP4基因啟動子屬于弱啟動子；FABP4基因核心啟動子是由CAAT盒組成的，轉(zhuǎn)錄起始點位于轉(zhuǎn)錄起始上游