家蠶組織蛋白酶D基因啟動(dòng)子相關(guān)功能序列的分析.pdf

1、組織蛋白酶D基因在家蠶變態(tài)發(fā)育過程中起著非常重要的調(diào)控作用。為探討家蠶組織蛋白酶D(BmCatD)基因的調(diào)控分子機(jī)制,本研究以BmCatD基因啟動(dòng)子為研究對(duì)象,以能感染AcMNPV的家蠶為研究材料,通過構(gòu)建含BmCatD調(diào)控元件啟動(dòng)子的雙熒光AcMNPV表達(dá)載體,結(jié)合Over-lap PCR基因定點(diǎn)突變方法,研究了該基因啟動(dòng)子調(diào)控元件在家蠶體內(nèi)的表達(dá)活性。獲得如下研究結(jié)果:
　　確定了該基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),該位點(diǎn)位于起始密碼子

2、ATG上游-90bp處。選定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前約1500bp的啟動(dòng)子序列為研究對(duì)象,生物信息學(xué)分析表明,BmCatD基因啟動(dòng)子中有3個(gè)蛻皮激素受體調(diào)控元件(ecdysone response element,EcRE):EcRE1,TTCGATTGACA(-109bp~-99bp);EcRE2,TTTAACTGAAA(-836bp~-826bp)和EcRE3,TTGGAATGAAA(-856bp~-846bp)。通過Over-lapPCR基

3、因定點(diǎn)突變方法,對(duì)EcREs調(diào)控元件相對(duì)保守堿基進(jìn)行突變,將突變的啟動(dòng)子片段克隆到雙熒光AcMNPV表達(dá)載體中,并檢測(cè)在家蠶脂肪體中的表達(dá)活性,結(jié)果表明,突變后的3個(gè)EcREs對(duì)BmCatD啟動(dòng)子的表達(dá)活性都呈下調(diào)影響,說明EcREs元件參與了BmCatD啟動(dòng)子活性的調(diào)控,且臨近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的EcRE1元件調(diào)控作用影響最大。
　　通過對(duì)該基因啟動(dòng)子序列5’端順次缺失,研究了啟動(dòng)子長(zhǎng)度對(duì)BmCatD基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用影響。對(duì)該基因啟

4、動(dòng)子+91―-1363bp序列進(jìn)行5’端順次缺失,用PCR方法構(gòu)建了6個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子序列片段:P1214(-1214bp)、P925(-925bp)、P801(-801bp)、P501(-501bp)、P234(-234bp)和P95(-95bp)。再分別將上述啟動(dòng)子片段克隆到雙熒光rAcMNPV供體質(zhì)粒中進(jìn)行病毒表達(dá)并接種家蠶,檢測(cè)5齡第4天熒光素酶報(bào)告基因在家蠶脂肪體中的表達(dá)活性。結(jié)果表明,長(zhǎng)短不同的啟動(dòng)子之間,其活性值有差異,