間苯三酚類衍生物治療帕金森氏病作用和機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 間苯三酚類衍生物對帕金森氏病模型的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　帕金森氏病(Parkinson's Disease，PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，主要病理特征為患者中腦多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡以及細(xì)胞內(nèi)路易氏小體的形成，導(dǎo)致黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能系統(tǒng)功能減退，從而使患者出現(xiàn)運(yùn)動障礙。間苯三酚類衍生物WYD1-8和WYD7-6是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所植化室合成得到的新型化合物，

2、前期研究提示兩個(gè)化合物均有較好的抑制炎癥作用，相關(guān)內(nèi)容已申請化合物專利保護(hù)。本研究在前期研究工作的基礎(chǔ)上，采用經(jīng)典的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)建立體內(nèi)PD模型及經(jīng)典致炎劑脂多糖(Lipopolysacchride，LPS)建立體外神經(jīng)炎癥模型，進(jìn)一步考察WYD1-8和WYD7-6的神經(jīng)保護(hù)及抑制神經(jīng)炎癥作用。
　

3、　體內(nèi)采用小鼠腹腔注射MPTP致亞急性PD模型，考察WYD1-8和WYD7-6的神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示，化合物WYD1-8和WYD7-6均能明顯改善MPTP致小鼠亞急性帕金森氏病的運(yùn)動障礙，并對小鼠黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，提高小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺(Dopamine，DA)含量。WYD1-8和WYD7-6可顯著抑制黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少炎癥因子白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(T

4、umornecrosis factor-α，TNF-α)的釋放。
　　應(yīng)用LPS刺激原代中腦混合培養(yǎng)體系作為體外神經(jīng)炎癥模型，進(jìn)一步考察WYD1-8和WYD7-6神經(jīng)保護(hù)及抑制神經(jīng)炎癥作用。研究發(fā)現(xiàn)，化合物WYD1-8和WYD7-6能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的原代中腦混合培養(yǎng)體系中小膠質(zhì)細(xì)胞活化，減少其活化標(biāo)志物離子鈣結(jié)合受體蛋白1(Ionized calcium binding adaptermolecule1，Iba-1)表達(dá)及炎癥

5、因子IL-1β和TNF-α的釋放。WYD1-8和WYD7-6能提高體系中酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)表達(dá)水平，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。
　　本研究證實(shí)了WYD1-8和WYD7-6具有較強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)炎癥抑制作用，其治療PD作用與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化劑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元密切相關(guān)。本研究表明化合物WYD1-8和WYD7-6是具有良好前景的治療PD的候選化合物。
　　第二部分 間苯三酚類衍生物

6、WYD7-6抑制神經(jīng)炎癥作用機(jī)制研究
　　本論文第一部分研究結(jié)果表明，間苯三酚類衍生物WYD7-6神經(jīng)保護(hù)作用與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥相關(guān)。然而其抑制神經(jīng)炎癥的具體機(jī)制尚不十分清楚。因此本部分研究內(nèi)容對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)方法，對WYD7-6處理后的MPTP加丙磺舒致小鼠慢性PD模型中腦總蛋白進(jìn)行分析比較。通過Western blot法驗(yàn)證以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，重點(diǎn)考察了Akt信號通路的上游

7、調(diào)控分子第十號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因編碼蛋白(Phosphatidylino sitol3，4，5-trisphosphate3-phosphataseand dual-specificity protein phosphatase，PTEN)及其相關(guān)信號通路。
　　應(yīng)用LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株作為神經(jīng)炎癥模型，首先考察PTEN與神經(jīng)炎癥的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞中的PTEN被抑制后，LPS引起的炎癥通路激活

8、以及炎癥因子釋放均增加，說明PTEN在調(diào)控神經(jīng)炎癥中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。PTEN的活性主要受到其上游磷酸酶的調(diào)控，蛋白質(zhì)組學(xué)定量結(jié)果及Western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，非受體酪氨酸蛋白激酶Src在不同處理組中腦中表達(dá)變化最明顯，因此對Src激酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)干擾Src激酶的表達(dá)后，LPS引起的炎癥反應(yīng)減少，說明Src激酶參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Src激酶表達(dá)降低后，LPS誘導(dǎo)的PTEN及Akt磷酸水平均降低，表明S

9、rc激酶對炎癥的調(diào)節(jié)作用可能是通過對PTEN及Akt通路的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的。
　　應(yīng)用LPS刺激BV2作為神經(jīng)炎癥模型，考察WYD7-6對于Src/PTEN/Akt通路的影響。結(jié)果表明，WYD7-6可抑制Src激酶介導(dǎo)的炎癥信號通路激活。在中腦原代培養(yǎng)體系中，干擾Src表達(dá)后，加入LPS、1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)等刺激劑

10、間接或直接損傷神經(jīng)元，考察WYD7-6是否通過抑制Src激酶發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果顯示，干擾Src表達(dá)后，WYD7-6的神經(jīng)保護(hù)作用被削弱，表明Src介導(dǎo)了WYD7-6抑制神經(jīng)炎癥的作用。體外應(yīng)用c-Src激酶抑制劑篩選試劑盒檢測WYD7-6對c-Src激酶的直接抑制作用，結(jié)果顯示W(wǎng)YD7-6并不能直接抑制酶活性，表明Src激酶并不是WYD7-6的直接作用靶點(diǎn)，WYD7-6可能通過調(diào)節(jié)Src激酶上游蛋白分子從而抑制Src激酶及其下游信號