缺氧狀態(tài)與小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞自噬關(guān)系的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury SCI)是骨科常見疾病，通常伴隨著脊柱骨折，如果出現(xiàn)下脊髓的損傷常常伴隨著骶尾部骨折，甚至骨盆骨折。
　　文獻報道，多種細胞作用機制和分子作用機制參與了二次繼發(fā)性損傷的發(fā)生發(fā)展，例如細胞死亡、炎癥過度反應(yīng)、巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞激活、神經(jīng)軸突退行性變、神經(jīng)脫髓鞘等。文獻報道缺氧狀態(tài)可以調(diào)控多種細胞信號傳導(dǎo)通路，小膠質(zhì)細胞是脊髓組織中重要的免疫細胞，在缺氧狀態(tài)下也可以感受到缺氧信號的刺激

2、，從而活化，啟動相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與脊髓損傷后的病理進程。但是其具體作用機制目前研究不多，也沒有統(tǒng)一的觀點。在目前有關(guān)細胞的低氧應(yīng)激的相關(guān)學(xué)術(shù)研究中，低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxic inducible factor，HIF-1)是目前缺血缺氧研究最多的一個因子，也是細胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的最主要的調(diào)節(jié)因子，廣泛表達于哺乳動物各種組織細胞中，是組織、細胞形成缺氧耐受共同的分子生物學(xué)機制。低氧誘導(dǎo)因子是一種會根據(jù)細胞內(nèi)氧濃度變

3、化，及時進行相關(guān)基因表達調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，其是由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α以及結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β共同組成的異二聚體。缺氧狀態(tài)下HIF-1α可以使自身分子開關(guān)開啟，使相關(guān)基因充分表達，調(diào)控細胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)，維持細胞正常功能。
　　Autophagy這一單詞來源于古希臘詞匯，被稱為自我吞噬，簡稱自噬。自噬(Autophagy)是在生物進化過程中所產(chǎn)生的一種物質(zhì)、能量再循環(huán)途徑，對于細胞內(nèi)細胞器的正常功能起著重要作用。一般來說，自噬

4、的過程包括識別、封存轉(zhuǎn)運、吞噬以及溶酶體的降解等過程。正常狀態(tài)下脊髓中很難檢測到自噬的存在，但是當發(fā)生脊髓損傷(SCI)時，脊髓中自噬現(xiàn)象迅速出現(xiàn)，脊髓損傷后會出現(xiàn)細胞自噬現(xiàn)象早已被廣大學(xué)者的研究工作所證實，自噬也逐漸成為在脊髓損傷中的研究熱點，神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致了神經(jīng)細胞內(nèi)大分子物質(zhì)、脂類和細胞器的破壞，自噬的發(fā)生以及其對神經(jīng)細胞的作用不容質(zhì)疑，然而自噬激活對于脊髓損傷到底是有益還是有害目前尚有爭議，沒有定論。為了消除上述的相關(guān)爭議，本

5、課題組通過一系列的科研設(shè)計和實驗操作，檢測缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細胞對于HIF-1α表達以及自噬影響評估其病理生理學(xué)意義。具體的研究內(nèi)容分為以下幾部分:
　　第一部分 脊髓小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)以及缺氧環(huán)境模型的建立
　?。ㄒ唬嶒灧椒?
　　1、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　2、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細胞的分離與鑒定
　　3、BV2小膠質(zhì)細胞的的培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　4、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細胞及BV

6、2小膠質(zhì)細胞缺氧環(huán)境模型的建立
　　5、缺氧狀態(tài)下，檢測0-24小時，在不同時間點原代小膠質(zhì)細胞及BV2小膠質(zhì)細胞存活率
　　6、缺氧狀態(tài)下，檢測0-24小時，在不同時間點原代小膠質(zhì)細胞及BV2小膠質(zhì)細胞死亡率
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　　1、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細胞置于低氧培養(yǎng)箱中0小時，其生存率接近100％，隨著缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)時間的延長，生存率進行性降低，缺氧狀態(tài)下0小時，死亡率小于10％，隨著時間延長，死亡率進

7、行性升高。
　　2、BV2細胞置于低氧培養(yǎng)箱中0小時，其生存率接近100％，隨著缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)時間的延長，生存率進行性降低，缺氧狀態(tài)下0小時，死亡率小于10％，隨著時間延長，死亡率進行性升高。
　　第二部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細胞炎癥因子的表達及低氧誘導(dǎo)因子的表達
　　（一）實驗方法:
　　1、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時不同的時間點，使用ELISA方法檢測脊髓原代小膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-1β的表達水平
　

8、　2、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時不同的時間點，使用ELISA方法檢測脊髓原代小膠質(zhì)細胞炎癥因子TNF-α的表達水平。
　　3、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時不同的時間點，使用Western blot法檢測脊髓原代小膠質(zhì)細胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達水平。
　　4、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時不同的時間點，使用PCR法檢測脊髓原代小膠質(zhì)細胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)mRNA的表達水平。
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　

9、　1、ELISA檢測表明低氧環(huán)境明顯增加了IL-1β蛋白水平的表達，0h時，小膠質(zhì)細胞的炎癥因子的表達較少，3小時后IL-1β的表達急劇升高，6小時達到頂峰，之后隨著時間的延長，IL-1β的分泌逐漸減少。
　　2、ELISA檢測表明低氧環(huán)境明顯增加了TNF-α蛋白水平的表達，0h時，小膠質(zhì)細胞的炎癥因子的表達較少，3小時后TNF-α的表達急劇升高，6小時達到頂峰，之后隨著時間的延長，TNF-α的分泌逐漸減少。
　　3、Wes

10、tern blot檢測表明，低氧環(huán)境明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達，當缺氧培育箱培育為0h時，低氧誘導(dǎo)因子的表達非常少，3小時后低氧誘導(dǎo)因子的表達明顯升高，6小時達到頂峰，之后隨著時間的延長，低氧誘導(dǎo)因子的分泌逐漸減少。
　　4、PCR檢測表明，低氧環(huán)境明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)在mRNA水平的表達，當缺氧培育箱培育為0h時，低氧誘導(dǎo)因子的表達非常少，3小時后低氧誘導(dǎo)因子的表達明顯升高，6小時達到頂峰，之

11、后隨著時間的延長，低氧誘導(dǎo)因子的分泌逐漸減少。
　　第三部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達研究
　?。ㄒ唬嶒灧椒?
　　1、缺氧狀態(tài)下，檢測0-24小時，在不同時間點，使用Western blot法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(LC3)和Beclin1表達變化。
　　2、透射電子顯微鏡下觀測自噬體囊泡的變化
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　　1、Western blot檢測表

12、明，低氧環(huán)境明顯上調(diào)了LC3的表達，0h時，LC3的表達非常少，3小時后LC3的表達急劇升高達到頂峰，之后隨著時間的延長，LC3的分泌逐漸減少。
　　2、Western blot檢測表明，低氧環(huán)境明顯上調(diào)了Beclin1的表達，0h時，Beclin1的表達非常少，3小時后Beclin1的表達急劇升高達到頂峰，之后隨著時間的延長，Beclin1的分泌逐漸減少。
　　3、3小時后可以觀測到小膠質(zhì)細胞內(nèi)含有雙層囊泡形成，說明有自噬

13、體形成。
　　第四部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細胞自噬的調(diào)控機制
　　（一）實驗方法:
　　1、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達，ELISA法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞的炎癥因子分泌的變化
　　2、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，ELISA法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞的炎癥因子分泌的變化
　　3、缺氧

14、狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達，Western blot法檢測LC3和Beclin1的表達變化
　　4、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，Western blot法檢測LC3和Beclin1的表達變化
　　5、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達

15、，CCK-8法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞的生存率變化。
　　6、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時，不同的時間點使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，CCK-8法檢測脊髓小膠質(zhì)細胞的生存率變化。
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　　1、ELISA檢測表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞分泌炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α表達量增加
　　2、ELISA檢測表明，缺氧狀態(tài)

16、下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞分泌炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α表達量增加
　　3、Western blot檢測表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞LC3和Beclin1表達減少。
　　4、Western blot檢測表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞LC3和Beclin1表

17、達減少。
　　5、CCK-8檢測表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞的生存率降低。
　　6、CCK-8檢測表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達，脊髓小膠質(zhì)細胞的生存率降低。
　　總結(jié)：
　　缺氧狀態(tài)下，小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞隨著時間的延長，生存率逐漸下降，死亡率逐漸升高;低氧狀態(tài)下，明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)以及炎癥因