缺氧狀態(tài)與小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞自噬關(guān)系的研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury SCI)是骨科常見疾病，通常伴隨著脊柱骨折，如果出現(xiàn)下脊髓的損傷常常伴隨著骶尾部骨折，甚至骨盆骨折。
　　文獻(xiàn)報(bào)道，多種細(xì)胞作用機(jī)制和分子作用機(jī)制參與了二次繼發(fā)性損傷的發(fā)生發(fā)展，例如細(xì)胞死亡、炎癥過度反應(yīng)、巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)軸突退行性變、神經(jīng)脫髓鞘等。文獻(xiàn)報(bào)道缺氧狀態(tài)可以調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，小膠質(zhì)細(xì)胞是脊髓組織中重要的免疫細(xì)胞，在缺氧狀態(tài)下也可以感受到缺氧信號(hào)的刺激

2、，從而活化，啟動(dòng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與脊髓損傷后的病理進(jìn)程。但是其具體作用機(jī)制目前研究不多，也沒有統(tǒng)一的觀點(diǎn)。在目前有關(guān)細(xì)胞的低氧應(yīng)激的相關(guān)學(xué)術(shù)研究中，低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxic inducible factor，HIF-1)是目前缺血缺氧研究最多的一個(gè)因子，也是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)缺氧變化的最主要的調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物各種組織細(xì)胞中，是組織、細(xì)胞形成缺氧耐受共同的分子生物學(xué)機(jī)制。低氧誘導(dǎo)因子是一種會(huì)根據(jù)細(xì)胞內(nèi)氧濃度變

3、化，及時(shí)進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄激活因子，其是由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α以及結(jié)構(gòu)亞單位HIF-1β共同組成的異二聚體。缺氧狀態(tài)下HIF-1α可以使自身分子開關(guān)開啟，使相關(guān)基因充分表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)，維持細(xì)胞正常功能。
　　Autophagy這一單詞來源于古希臘詞匯，被稱為自我吞噬，簡(jiǎn)稱自噬。自噬(Autophagy)是在生物進(jìn)化過程中所產(chǎn)生的一種物質(zhì)、能量再循環(huán)途徑，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的正常功能起著重要作用。一般來說，自噬

4、的過程包括識(shí)別、封存轉(zhuǎn)運(yùn)、吞噬以及溶酶體的降解等過程。正常狀態(tài)下脊髓中很難檢測(cè)到自噬的存在，但是當(dāng)發(fā)生脊髓損傷(SCI)時(shí)，脊髓中自噬現(xiàn)象迅速出現(xiàn)，脊髓損傷后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞自噬現(xiàn)象早已被廣大學(xué)者的研究工作所證實(shí)，自噬也逐漸成為在脊髓損傷中的研究熱點(diǎn)，神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)、脂類和細(xì)胞器的破壞，自噬的發(fā)生以及其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用不容質(zhì)疑，然而自噬激活對(duì)于脊髓損傷到底是有益還是有害目前尚有爭(zhēng)議，沒有定論。為了消除上述的相關(guān)爭(zhēng)議，本

5、課題組通過一系列的科研設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于HIF-1α表達(dá)以及自噬影響評(píng)估其病理生理學(xué)意義。具體的研究?jī)?nèi)容分為以下幾部分:
　　第一部分 脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)以及缺氧環(huán)境模型的建立
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)方法:
　　1、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　2、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞的分離與鑒定
　　3、BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的的培養(yǎng)與形態(tài)觀察
　　4、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞及BV

6、2小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧環(huán)境模型的建立
　　5、缺氧狀態(tài)下，檢測(cè)0-24小時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)原代小膠質(zhì)細(xì)胞及BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率
　　6、缺氧狀態(tài)下，檢測(cè)0-24小時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)原代小膠質(zhì)細(xì)胞及BV2小膠質(zhì)細(xì)胞死亡率
　　（二）研究結(jié)果:
　　1、小鼠脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中0小時(shí)，其生存率接近100％，隨著缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生存率進(jìn)行性降低，缺氧狀態(tài)下0小時(shí)，死亡率小于10％，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率進(jìn)

7、行性升高。
　　2、BV2細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱中0小時(shí)，其生存率接近100％，隨著缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生存率進(jìn)行性降低，缺氧狀態(tài)下0小時(shí)，死亡率小于10％，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率進(jìn)行性升高。
　　第二部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)方法:
　　1、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時(shí)不同的時(shí)間點(diǎn)，使用ELISA方法檢測(cè)脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-1β的表達(dá)水平
　

8、　2、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時(shí)不同的時(shí)間點(diǎn)，使用ELISA方法檢測(cè)脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子TNF-α的表達(dá)水平。
　　3、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時(shí)不同的時(shí)間點(diǎn)，使用Western blot法檢測(cè)脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)水平。
　　4、缺氧狀態(tài)下，于0-24小時(shí)不同的時(shí)間點(diǎn)，使用PCR法檢測(cè)脊髓原代小膠質(zhì)細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)mRNA的表達(dá)水平。
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　

9、　1、ELISA檢測(cè)表明低氧環(huán)境明顯增加了IL-1β蛋白水平的表達(dá)，0h時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)較少，3小時(shí)后IL-1β的表達(dá)急劇升高，6小時(shí)達(dá)到頂峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，IL-1β的分泌逐漸減少。
　　2、ELISA檢測(cè)表明低氧環(huán)境明顯增加了TNF-α蛋白水平的表達(dá)，0h時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)較少，3小時(shí)后TNF-α的表達(dá)急劇升高，6小時(shí)達(dá)到頂峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α的分泌逐漸減少。
　　3、Wes

10、tern blot檢測(cè)表明，低氧環(huán)境明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)，當(dāng)缺氧培育箱培育為0h時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)非常少，3小時(shí)后低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)明顯升高，6小時(shí)達(dá)到頂峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧誘導(dǎo)因子的分泌逐漸減少。
　　4、PCR檢測(cè)表明，低氧環(huán)境明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)在mRNA水平的表達(dá)，當(dāng)缺氧培育箱培育為0h時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)非常少，3小時(shí)后低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)明顯升高，6小時(shí)達(dá)到頂峰，之

11、后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低氧誘導(dǎo)因子的分泌逐漸減少。
　　第三部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)研究
　?。ㄒ唬?shí)驗(yàn)方法:
　　1、缺氧狀態(tài)下，檢測(cè)0-24小時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)，使用Western blot法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(LC3)和Beclin1表達(dá)變化。
　　2、透射電子顯微鏡下觀測(cè)自噬體囊泡的變化
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　　1、Western blot檢測(cè)表

12、明，低氧環(huán)境明顯上調(diào)了LC3的表達(dá)，0h時(shí)，LC3的表達(dá)非常少，3小時(shí)后LC3的表達(dá)急劇升高達(dá)到頂峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3的分泌逐漸減少。
　　2、Western blot檢測(cè)表明，低氧環(huán)境明顯上調(diào)了Beclin1的表達(dá)，0h時(shí)，Beclin1的表達(dá)非常少，3小時(shí)后Beclin1的表達(dá)急劇升高達(dá)到頂峰，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Beclin1的分泌逐漸減少。
　　3、3小時(shí)后可以觀測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有雙層囊泡形成，說明有自噬

13、體形成。
　　第四部分 缺氧狀態(tài)下脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制
　　（一）實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子分泌的變化
　　2、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子分泌的變化
　　3、缺氧

14、狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)LC3和Beclin1的表達(dá)變化
　　4、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)LC3和Beclin1的表達(dá)變化
　　5、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)

15、，CCK-8法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的生存率變化。
　　6、缺氧狀態(tài)下，于0-12小時(shí)，不同的時(shí)間點(diǎn)使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的生存率變化。
　?。ǘ┭芯拷Y(jié)果:
　　1、ELISA檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α表達(dá)量增加
　　2、ELISA檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)

16、下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α表達(dá)量增加
　　3、Western blot檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞LC3和Beclin1表達(dá)減少。
　　4、Western blot檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞LC3和Beclin1表

17、達(dá)減少。
　　5、CCK-8檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的抑制劑2ME2，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的生存率降低。
　　6、CCK-8檢測(cè)表明，缺氧狀態(tài)下，使用HIF-1α的RNA阻斷，抑制HIF-1α的表達(dá)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的生存率降低。
　　總結(jié)：
　　缺氧狀態(tài)下，小鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生存率逐漸下降，死亡率逐漸升高;低氧狀態(tài)下，明顯增加了低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)以及炎癥因