缺氧腸上皮細(xì)胞自噬的變化及意義.pdf

1、目的:自噬是指由細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體等細(xì)胞器脫落的雙層膜包裹部分細(xì)胞質(zhì)和受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)，而后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過(guò)程，從而滿(mǎn)足細(xì)胞本身的代謝需要及細(xì)胞器的不斷更新。自噬在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用，在機(jī)體缺血缺氧性損害中也扮演著至關(guān)重要的角色。嚴(yán)重創(chuàng)傷及燒傷后易導(dǎo)致低血容量性休克，引起機(jī)體有效血容量減少導(dǎo)致全身組織缺血缺氧，機(jī)體為保證心腦血管等重要臟器血流供應(yīng)，發(fā)生血液重分布，即指皮膚、

2、骨骼肌及腹腔內(nèi)臟的血管收縮，而心、腦血管不收縮，從而保證心腦重要臟器血液供應(yīng)。在血液重分布情況下腸道是最常受累的器官，因腸道組織灌流不足、氧需求增加及高代謝所造成的缺氧，導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)與功能受損。目前缺血缺氧所致胃腸道上皮細(xì)胞的自噬情況尚不清楚，本研究利用體外缺氧模型模擬胃腸道缺血缺氧，動(dòng)態(tài)觀察人腸上皮細(xì)胞Caco-2在缺氧條件下的自噬變化情況，旨在了解缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞自噬的影響，為研究自噬在缺氧后腸上皮細(xì)胞損害中作用奠定一定的基礎(chǔ)。<

3、br>　　方法:
　　1.以正常培養(yǎng)的人腸上皮細(xì)胞株Caco-2為研究對(duì)象，分別于常氧處理組（正常對(duì)照組）及缺氧組（0.5h、1h、2h、6h、12h及24h）提取細(xì)胞總蛋白并測(cè)其蛋白濃度。
　　2.采用蛋白免疫印法跡檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及P62表達(dá)的變化，以反映缺氧后各時(shí)相點(diǎn)自噬相關(guān)分子水平的動(dòng)態(tài)變化。
　　3.于細(xì)胞缺氧前及缺氧后6h用透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬溶酶體的變化情況。
　　4.

4、GFP-LC3B融合蛋白示蹤腸上皮細(xì)胞，于缺氧前及缺氧后6h用激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體形成的情況。
　　結(jié)果:
　　1.與常氧處理組比較，缺氧0.5h后腸上皮細(xì)胞Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)水平即開(kāi)始增加，隨后呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，于缺氧12h后達(dá)到高峰，24h后有所降低，但仍顯著高于正常;P62蛋白表達(dá)在缺氧后則逐漸降低，于缺氧24h將至最低。
　　2.透射電鏡觀察缺氧前后腸上皮細(xì)胞自噬變化的結(jié)果表明，缺氧

5、后6h時(shí)腸上皮細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體增多，且明顯多于缺氧前水平，表明腸上皮細(xì)胞自噬水平增加。
　　3.GFP-LC3B融合蛋白示蹤腸上皮細(xì)胞顯示，缺氧6h后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光斑點(diǎn)顯著增加，表明自噬體形成也明顯增加。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧后腸上皮細(xì)胞自噬水平較正常對(duì)照組明顯升高，并且自噬水平在一定范圍內(nèi)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)。
　　2.缺氧腸上皮細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)水平顯著增加，而另一種