自噬在羊布魯桿菌Omp31誘導小膠質(zhì)細胞炎癥中的可能機制.pdf

1、1.目的：
　　本研究：
　　⑴用不同濃度Omp31處理BV-2細胞6h（文獻報道誘導自噬的時間），一是明確Omp31能否誘導BV-2細胞自噬，二是確定Omp31誘導自噬的合適濃度。
　　⑵用合適濃度的Omp31處理BV-2細胞不同時間，目的是驗證BV-2細胞發(fā)生自噬的時間是否和文獻報道時間吻合，以便進一步研究自噬在BV-2細胞炎癥中的。
　?、怯貌煌瑵舛鹊腞apa和3-MA處理BV-2細胞24h，以確定Rapa

2、誘導自噬的濃度及3-MA抑制自噬的濃度。
　　⑷用Omp31、Rapa及3-MA處理BV-2細胞，以確定自噬能否通過調(diào)控NF-κB(P65)通路影響TNF-α的表達。
　　2.方法：
　?、傺虿剪敆U菌Omp31誘導BV-2小膠質(zhì)細胞自噬
　?、?0、0.17、0.5、1.5、4.5、13.5)μg/mL Omp31處理BV-2細胞6h，用Western blot法檢測自噬相關蛋白LC3B的表達；RT-qPCR檢測

3、LC3B mRNA的相對表達水平；透射電鏡觀察BV-2細胞內(nèi)的自噬體；ELISA法檢測TNF-α、IL-6及IL-10的表達；
　　③0.5μg/mL Omp31處理BV-2細胞(0、6、12、24)h，用Western blot檢測自噬相關蛋白LC3B的含量；RT-qPCR檢測LC3B mRNA的相對表達水平；透射電鏡觀察BV-2細胞內(nèi)的自噬體；ELISA法檢測TNF-α、IL-6及IL-10的表達。
　?、躉mp31誘導

4、的自噬對BV-2細胞NF-κB(P65)通路的作用
　?、?2.5、5、10)μM Rapa、(2.5、5、10) mM3-MA預處理BV-2細胞24h，用We stern blot檢測自噬標志物LC3BⅡ蛋白的含量；
　　⑥Omp31、Rapa及3-MA處理BV-2細胞6h，用Western blot檢測自噬相關蛋白B eclin-1、LC3B、P62以及NF-κB(P65)通路相關蛋白IκBα、p-P65、t-P65的表

5、達；ELIS A法檢測TNF-α的表達；RT-qPCR檢測(Beclin-1、LC3B、TNF-α)mRNA的相對表達；透射電鏡觀察細胞內(nèi)自噬體；免疫熒光技術檢測p-P65蛋白入核。
　　3.結果：
　?、俨煌瑵舛萇mp31處理BV-2細胞6h，發(fā)現(xiàn)0.5μg/mLOmp31能使LC3B蛋白及m RNA的表達量增加，與其余各組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且能使LC3BⅡ蛋白含量增加(P<0.05)，同時在透射電鏡下

6、可見較多自噬體；
　　②各濃度組TNF-α、IL-6表達量均較對照組增加(P<0.05)，0.5μg/mL實驗組TNF-α、IL-6表達量較其他實驗組低(P<0.01)。各實驗組IL-10表達量較對照組均降低(P<0.05)，且不具有濃度依賴性；
　?、?.5μg/mLOmp31處理BV-2細胞不同時間，結果顯示，各實驗組LC3B蛋白的表達及LC3BⅡ蛋白含量較對照組增加(P<0.05)，6h組LC3BⅡ蛋白含量及LC3Bm

7、RNA表達量較其余各組增加(P<0.01)，并且在透射電鏡下可見較多自噬體；
　?、芨鲿r間組TNF-α、IL-6表達量均較對照組增加(P<0.01)，且具有時間依賴性，而IL-10表達量均較對照組減少(P<0.01)，與時間無關；
　　⑤5μM Rapa預處理BV-2細胞后LC3BⅡ蛋白含量較各組均增加(P<0.01)，2.5mM3-MA預處理 BV-2細胞能降低 LC3BⅡ蛋白含量，與其余各組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.

8、01)；
　　⑥Omp31、Rapa和3-MA處理BV-2細胞，結果顯示：Omp31和Rapa均能促進L C3B及Beclin-1蛋白表達，亦能促進二者mRNA的表達，且均能增加LC3BⅡ蛋白含量，以上結果與對照組結果相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3-MA對LC3B蛋白和mRN A的表達以及Beclin-1蛋白的表達無影響，但較對照組能降低LC3BⅡ蛋白含量，并且抑制Beclin-1 mRNA的表達(P<0.05)。Om

9、p31和Rapa都能降低P62蛋白含量，而3-M A則導致P62蛋白含量增加，與對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在透射電鏡下可見Omp31和Rapa均能誘導自噬體形成，而3-MA對自噬體形成有抑制作用。
　?、逴mp31、Rapa及3-MA均能使IκBα和t-P65蛋白含量降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Omp31能增加p-P65蛋白水平，而Rapa和3-MA都能使p-P65蛋白水平降低，與對照組相比

10、均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。用免疫熒光技術檢測 p-P65蛋白入核，可知Omp31能增加胞核內(nèi)p-P65蛋白的含量，而Rapa及3-MA使胞核內(nèi)p-P65蛋白含量減少；
　　⑧Omp31與對照組相比能增加TNF-α表達量(P<0.01)，而Rapa及3-MA則使TN F-α表達量降低(P<0.01)。與對照組相比，Omp31、Rapa和3-MA均能使TNF-α mRNA表達量降低(P<0.01)。
　　4.結論：