下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞增殖轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分:下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞增殖的抑制作用
　　目的:
　　本研究擬探索RbAp48在人宮頸癌的表達情況，進一步研究下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞增殖的影響。
　　方法:
　　1.組織芯片法檢測224例人宮頸癌及癌旁組織中RbAp48的表達;2.以siRNA干擾技術(shù)下調(diào)RbAp48的表達;3.Western blot法檢測siRbAp48下調(diào)人宮頸癌細

2、胞RbAp48的表達水平;4.MTT、平板克隆實驗檢測下調(diào)RbAp48后對人宮頸癌細胞株Hela、MS751、SiHa增殖的的影響;5.β-半乳糖苷酶染色檢測siRbAp48對Hela、MS751、SiHa細胞衰老的誘導作用;6.流式細胞術(shù)檢測siRbAp48對細胞周期和凋亡的作用;7.以荷瘤小鼠模型觀察下調(diào)RbAp48表達對宮頸癌細胞體內(nèi)增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.RbAp48在人宮頸癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組

3、織，宮頸癌組織中呈強陽性者占67.86％（152例），而癌旁組織呈強陽性者為19.15％（9例）（**P＜0.01）。2.siRbAp48可有效下調(diào)Hela、MS751、SiHa細胞中RbAp48的表達。3.Hela細胞在20nM siRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細胞增殖的效果，50nM作用達峰值;效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第4天，其生存率降至36.11±4.47％。4.MS751細胞在10nMsiRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細胞增殖的效果，50n

4、M作用達峰值，效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第7天，其生存率降至47.80±5.08％。5.SiHa細胞在30nMsiRbAp48作用下產(chǎn)生抑制細胞增殖的效果，50nM作用達峰值;效果最明顯為轉(zhuǎn)染后第5天，其生存率為79.35±8.50％。6.細胞克隆實驗結(jié)果顯示:Hela細胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是87.17±8.63和36.67±2.89;MS751細胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是

5、130±8.89和87.33±1.16;SiHa細胞siRNA NC對照組和siRbAp48組克隆形成數(shù)分別是36.67±2.31和31.67±2.09。7.Hela細胞在siRbAp48作用48小時后，G2/M期細胞比例上升為32.33±7.14％（**P＜0.01），顯示細胞發(fā)生了G2/M期阻滯; MS751細胞在siRbAp48作用96小時后G2/M期細胞比例上升為35.61±3.79％，顯示同樣發(fā)生了明顯的G2/M期阻滯。8.下

6、調(diào)RbAp48后Hela、MS751細胞胞內(nèi)顆粒增多，β-半乳糖苷酶染色出現(xiàn)藍染，呈明顯的衰老表征。9.Hela細胞在siRbAp48作用72小時出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，其凋亡率為54.65±9.06％(**P＜0.01); MS751細胞在siRbAp48作用120小時出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，其凋亡率為32.20±4.47％（*P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.RbAp48在人宮頸癌細胞中的表達顯著高于癌旁正常組織細胞。2.si

7、RbAp48能有效下調(diào)人宮頸癌細胞中RbAp48的表達。3.下調(diào)RbAp48表達可至Hela、MS751細胞發(fā)生G2/M期阻滯，誘導細胞發(fā)生衰老和凋亡，抑制細胞的增殖。4.下調(diào)RbAp48能增加人宮頸癌細胞對順鉑的敏感性。
　　第二部分:下調(diào)RbAp48表達抑制人宮頸癌細胞增殖的機制研究
　　目的:
　　探明下調(diào)RbAp48表達抑制人宮頸癌細胞增殖的作用機制。
　　方法:
　　1.Western blot法

8、檢測下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞Cyclin蛋白表達的影響;2.應用RNA干擾技術(shù)驗證Cyclin蛋白家族在下調(diào)RbAp48抑制宮頸癌細胞生長中的作用;3.Western blot法檢測Cyclin作用下游蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Rb、E2F1等的表達;4.以聯(lián)合共轉(zhuǎn)染的方法觀察相關(guān)蛋白在siRbAp48抑制宮頸癌細胞生長中的作用;5.MTT法檢測細胞體外增殖能力。
　　結(jié)果:
　　1.siRbAp48下調(diào)R

9、bAp48表達后，Hela、MS751細胞的CyclinD1、CyclinE1及CyclinH的表達均明顯下調(diào);相應的CDK2、CDK4、CDK6蛋白也明顯下調(diào)。2.下調(diào)RbAp48表達后Hela、MS751細胞的磷酸化Rb(P-Rb)和E2F1明顯降低。3.與Hela、MS751細胞不同，SiHa細胞在下調(diào)RbAp48表達后，盡管Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6、P-Rb、E2F1表達也均發(fā)生下調(diào)，但CyclinD1、

10、Cyclin H的表達并未發(fā)生明顯的變化。4.以siRb下調(diào)Rb表達后顯著拮抗siRbAp48對細胞增殖的抑制作用;在Hela細胞，生存率由34.94±2.71％提高到56.12±2.72％（**P＜0.01）;在MS751細胞，生存率由44.24±5.83％提高到86.04±9.28％（**P＜0.01）;在SiHa細胞，生存率由80.03±7.65％提高到92.36±4.89％（**P＜0.01）。5.應用siCyclin D1、s

11、iCyclin E1和siCyclin H能有效下調(diào)宮頸癌細胞中Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin H的表達;下調(diào)Cyclin D1和Cyclin H的表達后，能顯著抑制宮頸癌細胞的增殖，但下調(diào)Cyclin E1表達后抑制宮頸癌細胞增殖的效果則相對較弱。在Hela細胞中，siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1組的生存率分別為39.19±7.77％、40.10±4.02％和82.83±5.9

12、4％;在MS751細胞中，siCyclinD1、 siCyclinH和siCyclinE1組的生存率分別為51.55±11.70％、49.61±7.51％和88.88±12.80％;在SiHa細胞中，siCyclin D1、 siCyclin H和siCyclinE1組的生存率分別為64.34±4.45％、80.74±11.57％和88.25±8.43％。6.以siRb下調(diào)Rb表達后能拮抗siCyclin D1對細胞增殖的抑制作用。在H

13、ela細胞，生存率由34.00±3.43％提高到46.54±2.96％（**P＜0.01）;在MS751細胞，生存率由50.41±4.17％提高到60.05±5.05％（**P＜0.01）;在SiHa細胞，生存率由66.05±6.56％提高到98.33±5.61％（**P＜0.01）。7.下調(diào)Rb表達后可拮抗siCyclin H對細胞增殖的抑制作用。在Hela細胞，生存率由43.68±4.13％提高到77.54±5.47％（**P＜0.

14、01）;在MS751細胞，生存率由56.29±5.00％提高到86.84±6.95％（**P＜0.01）;在SiHa細胞，生存率由85.78±2.47％提高到97.54±3.57％（*半P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.下調(diào)RbAp48表達顯著抑制宮頸癌細胞中CyclinD1、CyclinE、CyclinH的表達。2.下調(diào)CyclinD1或CyclinH后可產(chǎn)生與下調(diào)RbAp48相同的抑制細胞增殖的效果。3.siRb可拮

15、抗siRbAp48、siCyclin D1及Cyclin H抑制人宮頸癌細胞增殖的作用。4.下調(diào)CyclinD1、Cyclin H表達，誘導細胞周期阻滯是siRbAp48抑制人宮頸癌細胞增殖的一個重要機制。5.下調(diào)Rb表達可降低siRbAp48抑制宮頸癌增殖的效果，表明siRbAP48對腫瘤的抑制作用部分是通過調(diào)節(jié)Rb-E2F通路實現(xiàn)的。
　　第三部分:下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞株MS751遷移侵襲的抑制及其機制研究

16、>　　目的:
　　探討了下調(diào)RbAp48表達對人宮頸癌細胞遷移侵襲的影響及其作用機制。
　　方法:
　　以劃痕實驗、Transwell小室檢測下調(diào)RbAp48表達后對人宮頸癌細胞株MS751遷移侵襲的影響，以Western bolt檢測Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、Snail、Twist、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.劃痕實驗和Transwell小

17、室實驗結(jié)果顯示下調(diào)RbAp48表達后MS751細胞的遷移和侵襲數(shù)均明顯減少。2.siRbAp48作用后MS751的間質(zhì)細胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin、MMP-2表達明顯受到抑制;而上皮細胞表型蛋白E-cadherin、 TIMP-2表達明顯升高，表明MS751細胞的上皮-間充質(zhì)樣變受到了抑制。3.進一步研究發(fā)現(xiàn)EMT上游調(diào)節(jié)蛋白Snail、Twist表達水平也發(fā)生了顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)RbAp