匹格列酮對(duì)AGEs誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞TNF-α、IL-1、MMP-13表達(dá)增多作用的研究.pdf

1、目的:
　　通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products，AGEs)對(duì)人軟骨細(xì)胞TNF-α、MMP-13、IL-1表達(dá)以及NF-κB活性水平的影響，以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ）特異性激動(dòng)劑匹格列酮對(duì)上述反應(yīng)的抑制作用，為匹格列酮這一2型糖尿病治療藥物用于骨關(guān)節(jié)炎(osteo

2、arthritis，OA)治療提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。
　　方法:
　　運(yùn)用機(jī)械分離與兩步酶順序消化法分離培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，并用Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色以及細(xì)胞免疫熒光對(duì)人軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。在體外分離培養(yǎng)的人軟骨上:
　　(1)不同濃度AGEs(1-100μg/ml)干預(yù)人軟骨細(xì)胞24h后采用Real-time PCR及Western blot檢測(cè)TNF-α、MMP-13、IL-1三者的mRNA及蛋白表達(dá)水平，采用Weste

3、rnblot檢測(cè)人軟骨細(xì)胞胞漿中IKBα及胞核中NF-κB p65的含量;
　　(2)不同濃度（1-100μg/ml）AGEs及不同處理時(shí)間(3、6、12、24h)干預(yù)人軟骨細(xì)胞后，檢測(cè)PPARγ的表達(dá)水平;
　　(3)預(yù)先加入不同濃度匹格列酮（1-50μM）與軟骨共同孵育2h，再加入100μg AGEs處理24h，檢測(cè)PPARγ、TNF-α、MMP-13與IL-1β的mRNA及蛋白表達(dá)水平，同時(shí)應(yīng)用Western blot

4、檢測(cè)人軟骨細(xì)胞胞漿中IKBα及胞核中NF-κB p65的含量。
　　結(jié)果:
　　(1)通過機(jī)械分離與兩步酶順序消化法獲得了數(shù)量多、純度高的人軟骨細(xì)胞;
　　(2)與對(duì)照組比較，AGEs可濃度依賴性地誘導(dǎo)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TNF-α、MMP-13、IL-1α、IL-1β表達(dá)增多，且以100μg/ml組作用最明顯;
　　(3)與對(duì)照組比較，AGEs處理組中軟骨細(xì)胞胞漿中IKBα含量明顯減少、而胞核中NF-κB p65的含

5、量明顯增多，且其作用隨著AGEs濃度增高而增加，以100μg/ml組作用最顯著;
　　(4)AGEs干預(yù)組中軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照和BSA對(duì)照組比較，且隨著AGEs濃度增加以及作用時(shí)間延長(zhǎng)，軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)水平越低;(5)預(yù)先加入匹格列酮后再加入AGEs處理軟骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞中TNF-α、IL-1、MMP-13水平顯著低于單獨(dú)AGEs處理組;
　　(5)匹格列酮+100μg/ml AGEs處理組

6、中，軟骨細(xì)胞核NF-κBp65含量明顯高于單獨(dú)AGEs處理組，而胞漿中IKBα含量顯著低于單獨(dú)AGEs處理組。
　　結(jié)論:
　　(1)AGEs可促進(jìn)NF-κB活化，誘導(dǎo)IL-1、MMP-13和TNF-α表達(dá)增多;
　　(2)AGEs能誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞PPARγ下調(diào);
　　(3)PPARγ特異性激動(dòng)劑匹格列酮能夠通過降低NF-κB活化水平，對(duì)AGEs誘導(dǎo)人軟骨細(xì)胞IL-1、MMP-13和TNF-α表達(dá)增多的反應(yīng)起到抑