杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞分解代謝和凋亡的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)構(gòu)建IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥模型，利用杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，從基因和分子水平研究杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞分解代謝及凋亡的影響情況，從而進(jìn)一步研究其作用機(jī)制和傳導(dǎo)通路。為中藥單體化合物治療OA提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而為下一步治療骨性關(guān)節(jié)炎提供一種新的方法。
　　方法：
　　1.大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)
　　無(wú)菌條件下切除SD大鼠雙側(cè)后肢，用眼科剪和刀片削下膝關(guān)節(jié)軟骨組織，用37℃的PBS緩

2、沖液沖洗剪下來(lái)的軟骨組織2～3次。將軟骨組織移至離心管，加入1ml0.25％胰蛋白酶，用眼科剪將滑膜組織剪成1mm4的塊狀組織。再加入2ml胰酶放入37℃孵箱30min，期間震蕩1-2次。拿出離心2000rmp，5min，將上層液體倒掉，用0.2％的Ⅱ型膠原酶消化2h，期間震蕩4-5次，然后離心2000rmp，5min，去除上清，根據(jù)軟骨組織塊的大小及含量的多少加入適量的DMEM完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清和青、鏈霉素各10萬(wàn)/L雙抗液

3、體），晃動(dòng)，攪勻。
　　2.軟骨細(xì)胞鑒定
　　倒置相差顯微鏡觀察:在軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)期通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察正常軟骨細(xì)胞的形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)情況、生長(zhǎng)特性及細(xì)胞密度，在軟骨細(xì)胞的原代，一代，二代分別觀察拍照。
　　阿爾新藍(lán)染色:用PBS溶液輕輕清洗細(xì)胞，去掉全培溶液。然后用4％多聚甲醛固定30min。加入1％的阿爾新藍(lán)溶液，染色過(guò)夜，用DH2O漂洗數(shù)次，直至無(wú)色，拿到顯微鏡下觀察拍照。
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4、膠原免疫組織化學(xué)染色:取一到三代的軟骨細(xì)胞滴在蓋玻片上，使用爬片技術(shù)，待細(xì)胞基本生長(zhǎng)成單層后，取出蓋玻片，以4％多聚甲醛固定20min。3％過(guò)氧化氫室溫下孵育10min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，滴加正常非免疫動(dòng)物血清室溫下孵育10min。然后除去血清，滴加1∶100兔抗-大鼠Ⅱ型膠原一抗，4℃過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。DAB顯色，

5、蘇木精復(fù)色，無(wú)水乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。正置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。
　　3.杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和毒性作用的測(cè)定
　　將軟骨細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，用1、10、20、50μM的杜仲苷以及完全培養(yǎng)基DMEM刺激24，48小時(shí)。用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。
　　4.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及分解代謝作用的影響
　　將軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，用1

6、、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘，隨后加入10 ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)24小時(shí)。
　　5.用Western blot檢測(cè)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞中，IKK、IBα及胞核NF-κB亞基p65的磷酸化及表達(dá)情況，確定NF-κB通路被激活的最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)而探討杜仲苷對(duì)IL-1β激活NF-κB通路的作用機(jī)制。
　　6.用Western blot檢測(cè)不同濃度杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)

7、胞內(nèi)IKK、IκBα及NF-κB亞基p65的磷酸化表達(dá)情況。用免疫熒光(Immunofluorescence microscopy)檢測(cè)不同濃度杜仲苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)下軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB亞基p65核轉(zhuǎn)移的情況。
　　7.在熒光酶標(biāo)儀或共聚焦顯微鏡下用熒光探針二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)檢測(cè)杜仲苷是否抑制IL-1β的刺激下軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。
　　8.杜仲苷對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響
　　將軟

8、骨細(xì)胞接種于6孔板中，用1、10、20、50μM的杜仲苷及完全培養(yǎng)基DMEM刺激30分鐘，隨后加入10ng/ml白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)培養(yǎng)24小時(shí)。收集細(xì)胞，加入帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的AnnexinV及碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液，利用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡百分比。
　　9.利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3及C

9、leavedCaspase-9表達(dá)情況。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)取這些數(shù)據(jù)的平均值，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0完成。
　　結(jié)果:
　　1.杜仲苷在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)毒性作用:
　　CCK8結(jié)果顯示，杜仲苷在一定濃度范圍(1、10、20、50μM)對(duì)軟骨細(xì)胞沒(méi)有顯著的毒性作用。不同濃度杜仲苷對(duì)軟骨細(xì)胞的活力影響，采用One-WayANO

10、VA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷得出OD值總體方差齊性(P=0.287)。
　　2.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥及分解代謝
　　RT-PCR結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下軟骨細(xì)胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的mRNA水平顯著提高，與加入培養(yǎng)基的對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明，其

11、余組與IL-1β組比較，軟骨細(xì)胞中上述基因的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Griess Reagent結(jié)果顯示在10ng/ml IL-1β刺激下NO產(chǎn)生同樣增多，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明與IL-1β組比較，其余組NO產(chǎn)生水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=21.297，P＜0.001，表1-7)，隨著濃度的增高抑制的程度隨之增強(qiáng)。
　　Western blot結(jié)果與RT-PCR的結(jié)果相似，在10ng/ml IL

12、-1β刺激下軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2的蛋白水平也顯著提高，伴隨著加入杜仲苷濃度的增加，軟骨細(xì)胞內(nèi)的MMP-3、MMP-9、MMP-13、iNOS、COX-2蛋白表達(dá)也逐漸被抑制，加入50μM杜仲苷的抑制作用最為明顯。
　　3.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β刺激的軟骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB的激活
　　在IL-1β的刺激作用下，隨著時(shí)間變化(0、0.5、1、2、6h)，NF-κB通路逐漸被激活而

13、后恢復(fù)，軟骨細(xì)胞內(nèi)的NF-κB系統(tǒng)內(nèi)的IκBα逐漸降解，IKK磷酸化，而NF-κB的亞基p65的磷酸化程度逐漸增高，在2小時(shí)達(dá)到高峰，6小時(shí)后下降，正常組無(wú)此效應(yīng)。IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷(1、10、20、50μM)所抑制，隨著加入的不同濃度(1、10、20、50μM)，抑制作用逐漸增強(qiáng)，在50μM濃度下，作用最為明顯。
　　免疫熒光結(jié)果顯示，在IL-1β的刺激作用下，熒光標(biāo)記的NF-κB的亞基p

14、65從細(xì)胞胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB通路被激活。被IL-1β刺激的軟骨細(xì)胞，加入杜仲苷后熒光標(biāo)記的p65多數(shù)存在于細(xì)胞漿內(nèi)而非細(xì)胞核內(nèi)，證明了IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞NF-κB系統(tǒng)激活的效應(yīng)能夠被杜仲苷所抑制。
　　4.杜仲苷降低白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞內(nèi)活性氧族(ROS)水平
　　共聚焦顯微鏡下顯示IL-1β能夠顯著提升軟骨細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，與單純培養(yǎng)基對(duì)照組比有顯著的差異。而加入杜仲苷組軟骨細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱

15、，提示杜仲苷能夠顯著降低IL-1β提升軟骨細(xì)胞ROS的水平。采用One-WayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出ROS水平總體方差齊性(P=0.885)?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明，與IL-1β組相比，加入50μM杜仲苷的軟骨細(xì)胞中ROS水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(F=6.003，P=0.005，表2-2)。
　　5.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡<

16、br>　　流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，加入不同濃度的杜仲苷后，可見(jiàn)軟骨細(xì)胞凋亡活性明顯下降，并呈量效關(guān)系。采用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Levene's Test方法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中加入不同濃度杜仲苷和IL-1β得出凋亡率總體方差齊性(P=0.082)?；诜讲铨R性的方差分析結(jié)果表明，與IL-1β組相比，加入不同濃度杜仲苷的軟骨細(xì)胞凋亡率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義(F=86.66，P＜0.001，表2-1)。

17、r>　　6.杜仲苷抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　在IL-1β刺激下促凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9表達(dá)水平增高，而同時(shí)加入杜仲苷與IL-1β組的軟骨細(xì)胞內(nèi)Bax、Cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)水平有所降低，對(duì)于凋亡保護(hù)蛋白Bcl-2，IL-1β刺激下并沒(méi)有明顯升高，反而下降，在同時(shí)加入杜仲苷與IL-1