沉默PRSS1對胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲的影響.pdf

1、[目的]通過沉默 PRSS1基因的表達(dá)，觀察對胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲的影響，探討PRSS1影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的分子機(jī)制。
　　[方法]1.采用免疫組織化學(xué)染色結(jié)合組織芯片（含正常胃粘膜、癌旁、高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織）檢測胃癌組織中PRSS1蛋白的表達(dá),并分析其表達(dá)的意義。2.利用siRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRi-PRSS1干擾質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞，

2、經(jīng)殺稻瘟菌素Blasticidin S HCl篩選，建立PRSS1穩(wěn)定低表達(dá)的MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞系。利用RT-PCR和Western blot檢測MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞中PRSS1 mRNA和蛋白的表達(dá)。3.運(yùn)用MTT法、平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測PRSS1低表達(dá)對MGC803細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和遷移侵襲的影響。
　　[結(jié)果]1.免疫組織化學(xué)染

3、色結(jié)果顯示：高分化、中分化、低分化胃腺癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中，PRSS1蛋白表達(dá)較正常胃粘膜組織、癌旁組織表達(dá)增加，且癌旁組織中的表達(dá)強(qiáng)于正常胃粘膜組織。2.構(gòu)建pcDNA6.2?-GW/EmGFP-miRi-PRSS1干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染 MGC803細(xì)胞,篩選后建立 PRSS1穩(wěn)定低表達(dá)的MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞系。RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞中PRSS

4、1 mRNA和蛋白表達(dá)量較空白組和載體對照組中mRNA和蛋白表達(dá)量均降低（P＜0.05）。3.PRSS1低表達(dá)對MGC803細(xì)胞增殖的影響：1）MTT結(jié)果顯示，空白組MGC803細(xì)胞的增殖率為0.814±0.003，干擾組 MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞的增殖率為0.501±0.002，載體對照組 MGC803/miRi細(xì)胞的增殖率為0.791±0.002?？瞻捉M MGC803細(xì)胞增殖率明顯高于干擾組MGC803/miRi-PR

5、SS1細(xì)胞（P＜0.05）,表明 PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞的增殖活性降低（P＜0.05）。2）平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示,干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞的克隆數(shù)為23±2個(gè),空白組MGC803細(xì)胞和載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞的克隆數(shù)分別為98±5個(gè)和89±3個(gè),分別較干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞多75±3個(gè)和66±4個(gè)（P＜0.05）,表明 PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞集落形成能力減弱（

6、P＜0.05）。4.PRSS1低表達(dá)對 MGC803細(xì)胞遷移侵襲的影響：1）劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，劃痕24h小時(shí)末空白組MGC803細(xì)胞的遷移距離為188±8um，干擾組 MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞和載體對照組 MGC803/miRi細(xì)胞的遷移距離分別為105±3um和179±6um。空白組MGC803細(xì)胞和載體對照組 MGC803/miRi細(xì)胞遷移距離分別較干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞多83±5um和74±3u

7、m（P＜0.05）,表明PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞遷移能力減弱（P＜0.05）。2）Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，空白組 MGC803細(xì)胞遷移數(shù)為267±36個(gè),干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞遷移數(shù)為60±8個(gè),載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞遷移數(shù)為245±32個(gè)。與空白組 MGC803和載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞比較,干擾組 MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞遷移數(shù)分別少207±28個(gè)和18

8、5±24個(gè)（P＜0.05）,表明PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞遷移能力降低（P＜0.05）。3）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，空白組MGC803細(xì)胞和載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為48±8個(gè)和40±7個(gè),干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為15±4個(gè)?？瞻捉MMGC803細(xì)胞和載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞分別與干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞比較，其穿膜細(xì)胞數(shù)分別多33

9、±4個(gè)和25±3個(gè)（P＜0.05），表明PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞侵襲能力降低（P＜0.05）。5.PRSS1低表達(dá)對MGC803細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞術(shù)顯示，與空白組MGC803細(xì)胞和載體對照組MGC803/miRi細(xì)胞比較，干擾組MGC803/miRi-PRSS1細(xì)胞G0/G1期比率增加，而S期比率則降低（P＜0.05），表明PRSS1低表達(dá)后MGC803細(xì)胞的發(fā)生周期阻滯。
　　[結(jié)論]1.PRSS1蛋白在胃癌組織