RNA干擾RhoGDI2對DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲的影響.pdf

1、目的：研究證明，Rho GDI在Rho GTPases活性調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用，Rho GDI2是Rho GDI家族中三名成員之一，在不同的腫瘤中發(fā)揮著抑癌或促癌的作用。我們前期工作表明，二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）能使RhoGDI2表達(dá)下調(diào)，且證實DADS可能通過影響Rac1/LIMK1通路，抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。Rho GDI2是位于Rac1/LIMK1通路的上游分子，本研究旨在探討Rho GD

2、I2沉默對DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲的作用，以闡明Rho GDI2是抗胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要靶點。
　　方法：構(gòu)建含有編碼人RhoGDI2基因序列的RhoGDI2-EGFP/真核表達(dá)載體，繼而將載體轉(zhuǎn)染 MGC803細(xì)胞，建立 RhoGDI2沉默表達(dá)的RhoGDI2/MGC803細(xì)胞系。運用RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RhoGDI2 mRNA和RhoGDI2蛋白表達(dá)水平。運用West

3、ern blot和RT-PCR測定DADS處理前后RhoGDI2，Rac1，Pak1，Limk1的表達(dá)情況，運用劃痕實驗、Transwell侵襲實驗和裸鼠成瘤實驗，測定DADS處理前后，RhoGDI2沉默表達(dá)對MGC803細(xì)胞遷移、侵襲和成瘤能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1、pcDNA6.2/Rho GDI2-miRNA/MGC803重組細(xì)胞的構(gòu)建委托上海Invitrogen公司構(gòu)建pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiR

4、-Rho GDI2干擾質(zhì)粒并成功抽提質(zhì)粒。將4組干擾載體及空載體分別轉(zhuǎn)入MGC803細(xì)胞，經(jīng)G418篩選2周后，于顯微鏡下觀察，可見視野內(nèi)布滿綠色熒光，表明陽性克隆形成。運用Western-blot技術(shù)及RT-PCR技術(shù)對沉默效率進(jìn)行檢測，各轉(zhuǎn)染組相較于空載體轉(zhuǎn)染組，RhoGDI2蛋白及 mRNA表達(dá)水平均有不同程度下降，其中RhoGDI2-miRNA1轉(zhuǎn)染組沉默效果最明顯，故后續(xù)試驗細(xì)胞采用 RhoGDI2-miRNA1/MGC803

5、細(xì)胞。
　　2．Rho GDI2沉默對DADS抑制MGC803細(xì)胞遷移與侵襲的影響細(xì)胞劃痕實驗表明：24h后，轉(zhuǎn)染組劃痕間距明顯小于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0.05）；經(jīng) DADS處理后各組劃痕間距明顯小于處理前（P<0.05）；經(jīng)DADS處理后轉(zhuǎn)染組間距明顯小于經(jīng)DADS處理后的未轉(zhuǎn)染組（P<0.05）；DADS處理前后，未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組間均不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；上述結(jié)果證實：RhoGDI2沉默能抑制細(xì)胞遷

6、移能力，RhoGDI2沉默能增進(jìn)DADS抑制細(xì)胞遷移的能力。
　　Transwell實驗表明：24h后，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組（P<0.05）；經(jīng)DADS處理后各組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于處理前（P<0.05）；經(jīng)DADS處理后轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯小于經(jīng)DADS處理后未轉(zhuǎn)染組（P<0.05）；DADS處理前后，未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組間均不具有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；上述結(jié)果證實：RhoGDI2沉默明顯抑制細(xì)胞

7、侵襲能力，RhoGDI2沉默能增進(jìn)DADS抑制細(xì)胞侵襲的能力。
　　2. Rho GDI沉默與DADS對下游信號分子RAC1、PAK1及LIMK1的影響Western blotting及RT-PCR結(jié)果示，轉(zhuǎn)染組相較于未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組，其RAC1、PAK1及LIMK1表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；經(jīng)DADS處理24小時后，各組RAC1、PAK1及LIMK1表達(dá)水平較處理前明顯降低（P<0.05）；未轉(zhuǎn)染組及空載體轉(zhuǎn)染組處

8、理前后其差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；
　　4. DADS與RhoGDI2沉默對細(xì)胞裸鼠成瘤能力的影響裸鼠成瘤結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組移植瘤體積、瘤重均有明顯減少（P<0.05）；各DADS處理組的移植瘤體積、瘤重較未處理前明顯減少（P<0.05）；表明Rho GDI2沉默及DADS均可抑制MGC803細(xì)胞成瘤能力，Rho GDI2沉默可增進(jìn)DADS對裸鼠成瘤能力的抑制作用。
　　5. DADS與 RhoG

9、DI2沉默對裸鼠移植瘤細(xì)胞形態(tài)及組織內(nèi) Ki-67，CD34,Vimentin,E-cadherin的影響。
　　HE染色結(jié)果示，與未轉(zhuǎn)染組相比，RhoGDI2沉默組細(xì)胞異型性降低，核漿比例減小，核染色變淺，核分裂減少。而經(jīng) DADS處理后各組細(xì)胞較處理前也呈現(xiàn)出相同改變。
　　免疫組化結(jié)果示，與未轉(zhuǎn)染組相比，RhoGDI2沉默組Ki-67、CD34與Vimentin表達(dá)均明顯減少，而E-cadherin則增加。DADS處理

10、后，Ki-67、CD34與Vimentin表達(dá)較處理前明顯下調(diào)，E-cadherin明顯上調(diào)。表明RhoGDI2沉默及DADS均能上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Ki-67、CD34與Vimentin表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. RhoGDI2沉默可增強(qiáng)DADS對MGC803細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用；
　　2. RhoGDI2沉默及DADS通過Rac1/PAK1/LIMK1通路抑制MGC803細(xì)胞遷移侵襲；