Pin1蛋白家族的結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、蛋白質(zhì)脯氨酸前的絲氨酸或蘇氨酸的可逆磷酸化是一種重要的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控機(jī)制。近來(lái)發(fā)現(xiàn)的肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶Pinl能特異地識(shí)別和結(jié)合蛋白質(zhì)磷酸化的絲/蘇-脯氨酸基序，催化磷酸化的絲/蘇-脯氨酸肽鍵發(fā)生順?lè)串悩?gòu)，從而改變磷酸化蛋白質(zhì)的功能。越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明這種構(gòu)型的改變影響了蛋白質(zhì)的催化活性、去磷酸化水平、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位及蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)等。而且，這種磷酸化后的調(diào)節(jié)機(jī)制在細(xì)胞生長(zhǎng)和疾病發(fā)生如癌癥和阿爾茨海默氏

2、病中起重要作用。但目前對(duì)于Pinl的這種催化調(diào)節(jié)機(jī)制、以及其與底物相互作用的研究還很少。 本文主要對(duì)人類(lèi)Pinl蛋白及Pinl的兩個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸Trp34、Lys63、Cys113、Met130進(jìn)行定點(diǎn)突變，我們對(duì)這些蛋白進(jìn)行了大量表達(dá)、分離、純化，然后用懸吊液滴蒸汽擴(kuò)散法制備得到晶體，通過(guò)回?cái)[法收集衍射數(shù)據(jù)并進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析。目前我們得到了Human Pinl-WT、Pinl-W34A、Pinl-K63A、Pi

3、nl-C113A、Pinl-M130A。研究結(jié)果表明突變體Pinl-W34A對(duì)底物磷酸化特異性的識(shí)別能力及在體外的催化功能均喪失，而突變體Pinl-K63A、Pinl-C113A其底物磷酸化特異性識(shí)別功能不受影響，但它的催化功能喪失；同時(shí)，從Pinl-K63A、Pinl-C113A和Pinl-M130A中我們發(fā)現(xiàn)PPIase結(jié)構(gòu)域可能存在兩個(gè)磷酸根結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)我們成功克隆、表達(dá)了只含有PPIase結(jié)構(gòu)域的擬南芥Pinl(AtPinl)