人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶原核表達(dá)及非放射性酶活性檢測體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、目的：以人體細(xì)胞普遍存在的多胺合成通路的關(guān)鍵酶S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶為研究對象，初步探索利用PEPC-MDH法檢測人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶酶活性的可能性，并從多方面驗(yàn)證和優(yōu)化，以期解決目前人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶抑制藥物高通量篩選方式單一且操作復(fù)雜的問題，進(jìn)一步為以AdoMetDC為靶標(biāo)的抗腫瘤藥物的高通量篩選提供一種簡捷的，非放射性的方法。
　　方法：(1)在NCBI基因庫中尋找人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶序列，并將所得質(zhì)粒的Ado

2、MetDC基因測序后與之進(jìn)行序列比對。(2)利用所得原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并表達(dá)目的蛋白，并利用親和層析，分子篩等獲得較高純度的目的蛋白。(3)利用所得蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，并與PEPC酶法耦聯(lián)后利用酶標(biāo)儀在340nm波長下檢測吸光值的變化，間接反映目的蛋白的酶活性。(4)在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用一種已知的AdoMetDC抑制劑MGBG，來檢測此方法是否能夠被用來檢驗(yàn)抑制劑的作用。(5)利用此方法探索空氣中CO2，酶促

3、反應(yīng)底物濃度，抑制劑濃度和反應(yīng)時間對本體系的影響，并得到最佳值，并提高穩(wěn)定性，使之能夠用于高通量的篩選。(6)初步利用此方法篩選本實(shí)驗(yàn)組利用計(jì)算機(jī)模擬并購買小分子化合物。(7)利用NADH在340nm的激發(fā)和在425nm發(fā)射的特性，在熒光酶標(biāo)儀上進(jìn)一步驗(yàn)證本方法。
　　結(jié)果：(1)成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)純化出高純度的人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶蛋白。(2)人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶與PEPC-MDH法相耦聯(lián)的酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明純化所得

4、AdoMetDC具有一定的催化活性，可以用于接下來的實(shí)驗(yàn)。(3)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)證明外源性的CO2對本系影響較??；各反應(yīng)物最優(yōu)濃度為：S-腺苷甲硫氨酸的濃度為1mM,MGBG的最高濃度為100mM，反應(yīng)時間段為0-5分鐘。(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果所顯示的穩(wěn)定性較好，能夠滿足抑制劑高通量篩選要求。（5）利用我們建立和完善后的體系篩選小分子化合物，并得到一種具有一定抑制力的抑制劑。(6)NADH的熒光特性能夠被用于本實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)充方法，但有待進(jìn)一步探索。