環(huán)境污染物DBP和AFTM1單克隆抗體制備及人體內(nèi)暴露水平研究.pdf

1、隨著科技的進步，經(jīng)濟的發(fā)展，環(huán)境問題越來越凸顯。2013年全國腫瘤登記中心對2010年收集到的腫瘤數(shù)據(jù)進行審核、整理和分析后發(fā)現(xiàn)近幾年腫瘤疾病的負擔(dān)日益嚴重，特別提到與環(huán)境相關(guān)的健康問題應(yīng)作為焦點進行跟蹤監(jiān)測。作為導(dǎo)致重要疾病的因素之一，環(huán)境問題受到越來越多人的關(guān)注與重視。
　　之前對環(huán)境污染物質(zhì)檢測的研究大多是針對大氣、土壤、食物等外環(huán)境的監(jiān)測，這些數(shù)據(jù)可以間接反映小分子環(huán)境污染物的主要暴露來源，從源頭控制人類過多的暴露。直接對

2、人體尿樣、血樣等生物樣本中的環(huán)境污染物質(zhì)進行內(nèi)暴露檢測能夠客觀的反映個體內(nèi)暴露水平，避免個體差異的影響;更有效的預(yù)測、預(yù)防特定環(huán)境污染物暴露劑量對人體危害;同時可以為環(huán)境管理者在研制有害物質(zhì)及致癌環(huán)境衛(wèi)生學(xué)標準、提出環(huán)境中有害化學(xué)物及致癌物的可接受濃度時提供科學(xué)理論依據(jù)，進而指導(dǎo)國家衛(wèi)生部門制定更有效的政策，提高國民的健康狀態(tài)。
　　目前針對小分子環(huán)境污染物的檢測方法有儀器分析法和免疫學(xué)分析方法兩種，傳統(tǒng)的儀器分析法（HPLC、G

3、C-MS等）不僅操作復(fù)雜，價格昂貴，通量低而且耗時長、靈敏度低，這些缺點限制了其在普通人群中的應(yīng)用與普及。免疫學(xué)的方法采用抗原抗體特異性結(jié)合的原理進行檢測。目前由于小分子環(huán)境污染物質(zhì)完全抗原的質(zhì)量低、抗體的特異性差以及方法的靈敏度低、通量低等嚴重的阻礙了小分子環(huán)境污染物質(zhì)檢測技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。
　　本研究在通過細胞融合技術(shù)、高強度多次的亞克隆篩選到特異性好、效價高的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立一種靈敏度高、通量高且操作簡便的檢測方法，

4、使其能夠適用于大批量環(huán)境污染物鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)和黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFTM1)內(nèi)暴露樣本的檢測。絕大多數(shù)小分子環(huán)境污染物分子量小，只具有反應(yīng)原性，而不具有免疫原性，因此針對同一小分子環(huán)境污染物需要首先合成2種不同的人工完全抗原作為免疫原和包被原，再選擇制備親和力高的特異性抗體，建立、優(yōu)化檢測方法后，對浙江省普通人群體內(nèi)的DBP和AFTM1進行檢測分析，獲得該人群內(nèi)暴露

5、水平的第一手資料。
　　一.兩種小分子環(huán)境污染物人工完全抗原的制備與獲得
　　小分子環(huán)境污染物如鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、黃曲霉毒素M1(AFTM1)，分子量分別為278.34與328，這類物質(zhì)分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，必須與載體蛋白結(jié)合制備人工完全抗原后才能有效的刺激動物體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗體。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵血清白蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)及多聚賴氨酸(PLL)。偶聯(lián)臂的應(yīng)用可以使得半抗

6、原遠離大分子載體，避免小分子半抗原被載體大分子遮蓋影響其免疫原性，更好的刺激免疫系統(tǒng)。目前應(yīng)用的連接臂原形有酸酐、碳二亞胺、戊二醛等。根據(jù)半抗原的結(jié)構(gòu)基團，分子中含有羧基和可羧化的半抗原可使用混合酸干法與碳二亞胺法，戊二醛法與重氮化法用于含有氨基或者可還原硝基半抗原的小分子偶聯(lián)，而含有羥基的半抗原可采用琥珀酸酐和羰基二咪唑作為偶聯(lián)臂。
　　針對DBP小分子環(huán)境污染物，該研究選用BSA與OVA作為偶聯(lián)載體。在4-硝基鄰苯二甲酸的基礎(chǔ)

7、上，首先創(chuàng)新型的選擇催化劑進行酯化合成4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯，然后選擇最優(yōu)的還原劑還原得到具有氨基結(jié)構(gòu)的4-氨基鄰苯二甲酸二丁酯，最后通過重氮化反應(yīng)偶聯(lián)蛋白載體獲得2種人工完全抗原。DBP-BSA作為免疫小鼠的免疫抗原，DBP-OVA作為建立方法的包被抗原。優(yōu)化實驗條件后，該合成方法較文獻中的方法產(chǎn)率提高，合成時間縮短。AFTM1-BSA和AFTM1-OVA的2種小分子環(huán)境污染物人工完全抗原則通過購買獲得，前者作為免疫抗原，后者作為包

8、被抗原。
　　二.兩種小分子環(huán)境污染物單克隆抗體的制備與檢測方法的建立
　　來自于同一株細胞的單克隆抗體比來自于不同只動物獲得的多克隆抗體相比，具有更高的特異性、更好的均一性并且可以體內(nèi)外大量制備，其來源和產(chǎn)量豐富等優(yōu)點。因此我們采用經(jīng)典的細胞融合的方法篩選得到陽性雜交瘤細胞并通過體內(nèi)培養(yǎng)、體外純化獲得足量的單克隆抗體。繼而通過優(yōu)化包被抗原濃度、抗體濃度與抗體稀釋液等多個條件建立最優(yōu)化的間接競爭ELISA(indirect

9、completeenzyme-linked immunosorbent assay, Ic-ELISA)檢測方法。
　　在競爭ELISA的方法中，采用制備得到的DBP-BSA抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細胞融合后經(jīng)4次篩選得到雜交瘤陽性細胞株，然后體內(nèi)大量制備單克隆抗體。在0.25 ug/ml的抗原包被濃度下，采用0.1％明膠稀釋液稀釋抗體16000倍，該方法靈敏度最高:IC50=7.34 ng/ml，線性范圍為0-50 ng/m

10、l，R2=0.994，最低檢測限為0.06 ng/ml，變異系數(shù)范圍為5.93-11.09％，回收率范圍97.8-114.3％。同時與GC-MS傳統(tǒng)儀器分析法相關(guān)性良好，且較文獻中其它各種方法相比，具有更強的特異性、更高的靈敏度、更好的精密度和準確度。
　　依托篩選得到的陽性雜交瘤細胞制備AFTM1單克隆抗體，優(yōu)化ELISA實驗后最佳包被抗原濃度為0.5 ug/ml，抗體稀釋2000倍，方法的最低檢測限為4 ng/L，IC50為0

11、.36 ng/ml，可接受變異系數(shù)和回收率分別為1.788-8.678％，94.21-102.3％。該方法比其他文獻檢測方法相比，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。
　　根據(jù)兩種小分子環(huán)境污染物的的單克隆抗體建立的ELISA方法除了特異性好、靈敏度高、操作簡單以外，與儀器分析方法相比極大的提高了檢測的通量，可用于大量樣本中環(huán)境污染物質(zhì)的檢測。
　　三.兩種小分子環(huán)境污染物人體內(nèi)暴露的檢測與分析
　　根據(jù)上述建立的方法，對1

12、246個普通人群樣本進行DBP和AFTM1內(nèi)暴露含量的檢測，檢測數(shù)據(jù)采用PRISM和SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。DBP在人體尿樣樣本中的檢出率為72.87％，所有檢測樣本的幾何平均值為3 ng/ml。女性、中年組和低教育程度的人群分別較男性、老人組和高教育組人群含量高。AFTM1的檢測范圍為0.0004094-0.9284 ng/ml，檢出率和幾何平均值分別為83.01％與0.09229 ng/ml。通過性別、文化程度與年齡分析，結(jié)果顯示