XCT790對(duì)缺氧、無血清及高糖誘導(dǎo)MSCs凋亡的影響.pdf

1、背景與目的:
　　糖尿病患者中，有15％發(fā)生糖尿病足部潰瘍(Diabetic foot ulcers，DFUs)，其危害大，常規(guī)治療療效不佳，世界各國(guó)醫(yī)學(xué)專家都在積極尋找到新的方法治療糖尿病周圍血管病變。近年來，自體干細(xì)胞移植療法治療缺血性疾病的療法逐漸得到肯定和重視。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源豐富，體外擴(kuò)增安全性好，成為治療糖尿病下肢缺血的最佳選擇之一。但是，由于缺氧、缺

2、營(yíng)養(yǎng)、炎癥等因素的影響，干細(xì)胞移植后大量凋亡，成為制約其療效的關(guān)鍵問題。
　　本課題組前期研究表明，過氧化物酶體增殖體激活受體γ輔活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）能激活MSCs的Bcl-2抗凋亡途徑，使MSCs耐受凋亡。但Bcl-2蛋白上游的調(diào)控機(jī)制還不甚清楚，有待進(jìn)一步研究。
　　雌激素相關(guān)受體α(estro

3、gen-related receptorα，ERRα)是世界上最早被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體之一，對(duì)能量代謝的活化起著重要作用，但鮮有文章研究ERRα在細(xì)胞凋亡途徑中的作用。課題組根據(jù)前期的研究和工作推測(cè)，PGC-1α有可能通過過氧化物酶增殖體激活受體γ（PPARγ）和/或ERRα這兩種核受體來實(shí)現(xiàn)，因此本文選擇ERRα為突破口研究其與MSCs凋亡以及Bcl-2基因表達(dá)的聯(lián)系。
　　我們利用ERRα的特異性拮抗劑XCT790拮抗ERRα，

4、觀察MSCs在缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)、高葡萄糖條件下耐受凋亡能力是否下降，驗(yàn)證ERRα與MSCs的凋亡是否相關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果:
　　1.購(gòu)買57BL/6小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞株，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)其分化為成脂和成骨細(xì)胞，油紅O染色和茜素紅染色結(jié)果為陽(yáng)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面抗原標(biāo)記，Sca-1、CD44呈陽(yáng)性，CD34、CD45為陰性。
　　2.MSCs正常培養(yǎng)條件預(yù)實(shí)驗(yàn)分為5組:1個(gè)空白對(duì)照組、4個(gè)不同濃度XCT790

5、組（培養(yǎng)基中分別加入0.25％ DMSO+0、5、10、20μmol/L XCT790），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。都采用含10％ FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。結(jié)果顯示各組間凋亡率無顯著差異(P＞0.05)。
　　3.MSCs凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的分為5組:1個(gè)正常培養(yǎng)對(duì)照組，在0.25％ DMSO+10％FBS、正常氧分壓條件下培養(yǎng);4個(gè)不同濃度XCT790干預(yù)組（培養(yǎng)基中分別加入0.25％DMSO

6、+0、5、10、20μmol/L XCT790）用3％ O2、無FBS、葡萄糖濃度25 mmol/L的培養(yǎng)條件誘導(dǎo)MSCs凋亡，在12和24 h時(shí)檢測(cè)凋亡率。24 h時(shí)0、5、10及20μmol/LXCT790干預(yù)組凋亡率為24.60％±1.37％，32.73％±3.01％，42.64％±4.46％ and61.35％±6.78％，5～20μmol/L干預(yù)組顯著高于0μmol/L干預(yù)組，且在5～20μmol/L內(nèi)呈劑量依賴性(P＜0.0

7、5，P＜0.01)。
　　4.在MSCs誘導(dǎo)凋亡24h時(shí)，Real-Time PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax基因和蛋白表達(dá)水平，5～20μmol/L XCT790干預(yù)組的Bcl-2 mRNA表達(dá)和Bcl-2/Bax比值顯著低于0μmol/L干預(yù)組(P＜0.05)，且Bcl-2/Bax比值呈劑量依賴性（P＜0.05）。在24 h時(shí)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平，5～20μmol/L XCT790干預(yù)組的Bcl-2蛋白表達(dá)和Bcl-

8、2/Bax比值顯著低于0μmol/L干預(yù)組(P＜0.05)，而Bax蛋白表達(dá)顯著高于0μmol/L干預(yù)組（P＜0.05），Bcl-2/Bax比值呈劑量依賴性（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.本實(shí)驗(yàn)采用的MSCs具有成骨、成脂分化的能力，表達(dá)Sca-1和CD44表面標(biāo)記，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45，符合小鼠MSCs的鑒定特征。
　　2.正常培養(yǎng)條件下加入不同濃度XCT790，24 h內(nèi)MSCs凋亡率沒有