全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選.pdf

1、目的：構(gòu)建抗肝癌人源噬菌體單鏈抗體庫，從抗體庫中篩選抗肝癌的噬菌體單鏈抗體(ScFv)，并對其進行鑒定和測序分析。 方法：體外致敏并用EBV轉(zhuǎn)化肝癌患者的PBMC。用PCR分別擴增VH和VL基因并組成ScFv基因。將ScFv基因與載體fuse5連接后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌MCl061，構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)型ScFv庫。用人肝癌細胞及人肝細胞對初級噬菌體抗體庫進行親和富集及phage—ELISA篩選。篩選獲得的陽性克隆進行ELISA及免疫組

2、化鑒定并測序。 結(jié)果：經(jīng)EBV轉(zhuǎn)化的4例肝癌患者PBMC，ELISA檢測均有抗肝癌抗體產(chǎn)生，經(jīng)多次PCR，擴增出6種VH(Y、μ)和9種VL(K、λ)基因，經(jīng)連接組成54種ScFv基因。將ScFv基因與載體連接后，導(dǎo)入大腸桿菌MCl．061。經(jīng)四環(huán)素抗性篩選，得到庫容為1.0×10<'8>的初級噬菌體抗體庫，噬菌體DNA中全長ScFv基因的插入率為80[％]。用人肝癌細胞系HepG2和人肝細胞系QSG-7701對抗體庫進行三輪正

3、負淘選和富集后，從中隨機挑取533個克隆進行ELISA篩選，得到179個陽性克隆，陽性率為33.6[％]。將179個陽性克隆進一步進行其他細胞系的鑒定，發(fā)現(xiàn)克隆A82對肝癌細胞系HepG2、人胚腎上皮細胞系HEK293呈強陽性反應(yīng)，而與正常肝細胞系QSG-7701、骨髓間質(zhì)干細胞HBMSC、原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC及其他人腫瘤細胞系反應(yīng)呈弱陽性或不反應(yīng)。細胞免疫組化結(jié)果與細胞ELISA結(jié)果基本一致；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與人肝細

4、胞癌組織有特異性反應(yīng)，而不與正常肝組織反應(yīng)，反應(yīng)部位主要見于胞膜、胞漿。對克隆A82進行測序分析，結(jié)果表明：A82全長742bp，含linker cDNA序列45bp，重鏈可變區(qū)基因與人胚系IgVH3-23有94.3[％]的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系IgV4-2有94.9[％]的同源性；V-D-J分別屬于 VH3-23-D2-21-JH6-linker-V4-2-JL2。 結(jié)論：應(yīng)用體外抗原致敏方法和EBV轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體