EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)的表達變化.pdf

1、肝缺血再灌注損傷（hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI）是肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等臨床治療過程中經(jīng)常會發(fā)生的并發(fā)癥，這也是引發(fā)患者肝移植失敗，肝功能衰竭及愈后較差的關(guān)鍵因素。眾多研究已表明：暫時性阻斷肝臟血流供應(yīng)，然后再重新恢復其灌注時可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)生大量高活性的活性氧族（reactiveoxygenspecies：ROS)，ROS對肝臟組織細胞引發(fā)的過氧化損傷是導致HIR

2、I的主要機制。ROS的成員主要有超氧陰離子（O2-.）、過氧化氫（H2O2）以及羥自由基(OH.)等。ROS的生物化學性質(zhì)極其活潑，能與胞內(nèi)和胞膜上的一些重要蛋白（如結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白）和脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而破壞胞膜的結(jié)構(gòu)，損害細胞功能，甚至引起細胞和組織的死亡。
　　肝臟不僅是糖類、蛋白和脂類等物質(zhì)的重要代謝場所，還是重要的分泌、排泄和生物轉(zhuǎn)化器官。因此，當其結(jié)構(gòu)和功能受到損害時必然會引起機體內(nèi)其他重要臟器的結(jié)構(gòu)和功能異常。

3、心臟是機體內(nèi)氧氣消耗量大、對缺血缺氧反應(yīng)極為敏感的臟器。當暫時阻斷肝臟血供再重新恢復其灌注，肝組織細胞遭受氧化應(yīng)激損傷時，心臟是否也會遭受過氧化損傷？有待研究。
　　超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutases，SOD）是機體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此，SOD是清除O2-的重要酶蛋白，在機體內(nèi)的抗過氧化過程具有重要作用。哺乳動物體內(nèi)共有三種SOD亞型：在線粒體內(nèi)以錳作為輔基的錳-超氧

4、化物歧化酶（Mn-SOD），在細胞胞漿中以銅和鋅作為輔基的銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。細胞外超氧化物歧化酶（extracellularSOD,EC-SOD)是機體內(nèi)唯一位于細胞外的SOD亞型，它依靠自身的肝素結(jié)合域(heparin-bindingdomain,HBD)能與細胞外基質(zhì)和細胞表面結(jié)合。以往眾多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但最近的實驗研究發(fā)現(xiàn)：細胞外的EC-SOD在機體內(nèi)的抗氧化應(yīng)

5、激和抗炎反應(yīng)中可能發(fā)揮了更重要的作用。研究顯示：心肌組織內(nèi)EC-SOD含量降低的病人，其發(fā)生高血壓和缺血性心臟疾病的風險明顯增加。EC-SOD與細胞外基質(zhì)結(jié)合能力下降也會增加心血管和缺血性心臟疾病的風險。此外，心臟衰竭患者的EC-SOD表達是降低的。這表明EC-SOD可能對維持心肌功能具有重要作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的表達如何變化，是否在此過程中發(fā)揮了抗氧化作用，未見報道。
　　本研究通過阻斷大鼠肝左葉

6、、肝中葉的血管和膽管蒂再重新恢復其灌注的方法制造大鼠HIRI模型，然后觀察大鼠心肌組織內(nèi)MDA含量、H2O2含量、血清LDH水平，以及EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平。探討肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用。
　　目的：
　　觀察大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的MDA和H2O2含量，抗氧化酶EC-SOD的mRNA和蛋白表達水平的改變，探討肝缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織的氧化應(yīng)

7、激狀態(tài)及EC-SOD在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　選用12只雄性健康Wistar大鼠，體重190-210g，于河北醫(yī)科大學實驗動物中心購得。隨機分為肝缺血再灌注損傷組(HIRI)6只，對照組（Con）6只。6％水合氯醛（自配）按0.5ml／kg計量，對大鼠進行腹腔注射，將其麻醉。參照Kohli等人的方法，用玻璃針輕柔分離肝血管和膽管，游離出通往肝中葉和肝

8、左葉的血管和膽管蒂，用無損傷血管夾將其夾閉。30分鐘后移開血管夾，恢復肝中葉和肝左葉的血液供應(yīng)，制造肝實質(zhì)70%的肝缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠麻醉后，只游離肝中葉和肝左葉的血管和膽管蒂，30分鐘后關(guān)腹。肝臟恢復血供6小時后再次將其麻醉，收集大鼠血液，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和LDH（血清乳酸脫氫酶）的活性測定；取大鼠肝臟，將其置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，用HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學改變；取大鼠心臟，用冰生理鹽水洗去心

9、臟表面及心腔內(nèi)的余血，并將心臟置于液氮中用于EC-SOD的mRNA水平和蛋白水平測定，以及MDA含量和H2O2含量測定。
　　2、測定指標及方法
　　2.1HE染色法觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　肝組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后，進行切片，厚度約5μm，用蘇木精伊紅染色，在日產(chǎn)Olympus光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　2.2大鼠血清中ALT活性的測定
　　大鼠血液未經(jīng)抗凝

10、處理，3000rpm離心10min后分離血清，用血清ALT全自動生化分析儀測定其含量。
　　2.3大鼠血清中LDH活性的測定
　　大鼠血液LDH活性的測定，按照試劑盒的操作說明，采用LD-L速率法測定。
　　2.4大鼠心肌勻漿的制備以及MDA含量的測定
　　從-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注損傷組及對照組大鼠的心肌組織，按照10mg/100μl的比例，加入4度勻漿緩沖液(PH7.4，磷酸鉀緩沖液50mmol/L，P

11、MSF1mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1%Tween-20，β-巰基乙醇5mmol/L，EDTANa31mmol/L)，冰浴中勻漿，4℃勻漿液4000rpm離心20分鐘，取上清即制成10％心組織勻漿，心組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.5大鼠心肌組織H2O2含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(

12、50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTANa3，5mmol/Lβ-巰基乙醇)，冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％心肌組織勻漿。心肌組織勻漿內(nèi)H2O2含量采用鉬酸比色法測定，以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/gpro)表示。
　　2.6大鼠心肌組織EC-SODmR

13、NA水平測定
　　用TRIzol法提取大鼠心肌組織總RNA。將3μgRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用GAPDH作為內(nèi)參照，進行RT-PCR。用EC-SOD擴增產(chǎn)物的灰度值與GAPDH擴增產(chǎn)物的灰度值相比，表示目的基因EC-SOD的相對表達量。
　　2.7大鼠心肌組織EC-SOD蛋白水平測定
　　采用Westernblotting的方法測定大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD蛋白的相對表達量。將-80度冷凍的大鼠心肌組織制成勻漿液,離

14、心后取上清。采用改良的Lowry法進行蛋白總量測定。大鼠心肌組織的蛋白上樣量為62ug。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室溫靜置過夜。洗膜后，再加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG二抗。按照發(fā)光試劑操作說明進行顯影、定影、晾干。后對膠片進行掃描處理，并做圖像分析，以EC-SOD條帶的灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值之比表示EC-SOD的相對表達量。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠肝臟形態(tài)學改變
　　在

15、光學顯微鏡下可見肝缺血再灌注損傷組大鼠的肝組織淤血嚴重，肝細胞受壓萎縮，肝血竇擴張充血明顯，肝細胞胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn)并且染色變淺，有部分肝細胞水腫，染色變淺，體積增大。對照組大鼠肝細胞排列整齊成條索狀，圍繞中央靜脈排列成放射狀，肝血竇無擴張充血大小均勻。
　　2、血清ALT水平
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Co

16、n組（P<0.01）。
　　3、血清LDH水平
　　Con組大鼠血清中LDH為481.5±67.15U/L，而HIRI組血清LDH為658.83±94.15U/L。HIRI組大鼠血清LDH水平明顯高于Con組（P<0.01）
　　4、心肌組織內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠心肌組織MDA的含量為9.24±1.72mmol/g，而HIRI組MDA含量為12.73±1.84mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織MDA的

17、含量明顯高于Con組（P<0.01）
　　5、心肌組織內(nèi)H2O2含量
　　Con組大鼠心肌組織內(nèi)H2O2的含量為10.56±1.72mmol/g，而HIRI組心肌組織內(nèi)H2O2含量為14.63±2.25mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)H2O2的含量明顯高于Con組（P<0.01）
　　6、大鼠心肌組織內(nèi)EC-SODmRNA的相對表達量
　　大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化物酶EC-SODmRNA的相對表達量采用RT-P

18、CR的方法測定。計算與內(nèi)參照GAPDH的比值得出其相對表達量并進行結(jié)果統(tǒng)計。分析表明：HIRI組大鼠心肌組織的EC-SODmRNA水平（1.01±0.15）均明顯高于Con組（0.69±0.11,P<0.01）。說明HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD的表達明顯增強。
　　7、大鼠心肌組織中EC-SOD的蛋白相對表達量
　　采用Westernblotting的方法測定大鼠心肌組織內(nèi)EC-SOD的蛋白相對表達量。計算與內(nèi)參照G

19、APDH的比值得出相對表達量并進行結(jié)果統(tǒng)計。分析表明：HIRI組大鼠心肌組織中EC-SOD蛋白的相對表達量（0.69±0.09）明顯高于對照組（0.48±0.07）（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、結(jié)扎肝左、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。
　　2、大鼠肝缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)MDA含量、H2O2含量和血清LDH活性均明顯增加，提示：心肌組織已遭受過氧化損傷，心肌功能受損。
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