PrxⅢ在大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型心內(nèi)的表達變化.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是臨床肝臟外科手術(shù)如肝臟移植、肝部分切除等過程中經(jīng)常遇到的病理生理現(xiàn)象，也是導(dǎo)致肝臟移植失敗，肝臟功能衰竭，病人愈后較差的重要原因。研究證實:缺血再灌注時可以產(chǎn)生大量的活性氧族(reactive oxygenspecies:ROS)對肝臟組織細胞的過氧化損害是導(dǎo)致HIRI的主要機制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫

2、(H2O2)以及羥自由基(OH)等。它們的化學(xué)性質(zhì)非?；顫姡恍┲匾陌ず桶麅?nèi)的蛋白（包括結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白）可與其發(fā)生過氧化反應(yīng)，改變細胞膜的結(jié)構(gòu)，影響細胞功能，甚至引起細胞和組織死亡。
　　肝臟是機體重要的物質(zhì)代謝場所。其功能受損必然引起鄰近或遠端臟器的代謝和功能異常。心臟是機體內(nèi)耗氧量大、對缺血缺氧反應(yīng)非常敏感的臟器之一。當阻斷肝臟血液供應(yīng)再恢復(fù)其灌注的過程中，肝臟處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，此時心臟是否也會遭受過氧化損傷？有待

3、研究。
　　PrxⅢ是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系Peroxiredoxin(Prx)的家族成員之一。研究表明:PrxⅢ是在細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成產(chǎn)生，而后經(jīng)定位信號定位于線粒體。PrxⅢ是整個Prx家族中唯一特異性的定位于線粒體內(nèi)的酶蛋白。細胞內(nèi)的ROS主要來源于線粒體內(nèi)呼吸鏈的電子泄露。近些年的研究顯示:細胞線粒體內(nèi)H2O2的清除與PrxⅢ有密切關(guān)聯(lián)。心臟是人體重要器官，其耗氧量非常強大，心肌細胞的能量供給主要是通過線粒體的氧化磷

4、酸化。在此過程中會有大量ROS生成。因此，心臟是機體內(nèi)最容易受到ROS過氧化損傷的器官。在HIRI發(fā)生后，心肌組織PrxⅢ的表達如何變化，是否參與氧化應(yīng)激反應(yīng)？未見報道
　　本研究通過無損傷血管夾將通往大鼠肝中葉與肝右葉的血管和膽管蒂夾閉，30 min后移開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，然后觀察大鼠血清LDH水平、心肌組織內(nèi)MDA水平，PrxⅢ的mRNA和蛋白表達水平。探討肝臟缺血再灌注損傷后心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀

5、態(tài)以及 PrxⅢ的抗氧化作用。
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以及PrxⅢmRNA和蛋白表達水平的改變，探討其在心內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1、大鼠肝缺血再灌注損傷模型的制備及取材
　　選用12只雄性健康Wistar大鼠，體重190-210g，于河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購得。隨機分為肝缺血再灌注損傷組(HIRI)6只，對照組(Con)6只。6％水合氯醛（自配）

6、按0.5ml/kg計量，對大鼠進行腹腔注射，將其麻醉。參照Kohli等人的方法，用玻璃針輕柔分離肝血管和膽管，游離出通往肝中葉和肝右葉的血管和膽管蒂，用無損傷血管夾將其夾閉。30分鐘后移開血管夾，恢復(fù)肝中葉和肝右葉的血液供應(yīng)，制造肝實質(zhì)70％的肝缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠麻醉后，只游離肝中葉和肝右葉的血管和膽管蒂，30分鐘后關(guān)腹。肝臟恢復(fù)血供6小時后再次將其麻醉，收集大鼠血液，用于ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）和LDH（血清乳酸脫氫酶）

7、的活性測定;取大鼠肝臟，將其置于4％多聚甲醛溶液中進行固定，用HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變;取大鼠心臟，用冰生理鹽水洗去心臟表面和心腔內(nèi)的余血，將心臟置于液氮中用于PrxⅢ mRNA水平、蛋白水平測定以及MDA含量測定。
　　2、測定指標及方法
　　2.1 HE染色法觀察大鼠肝臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)
　　肝組織經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋后，進行切片，厚度約5μm，用蘇木精伊紅染色，在日產(chǎn)Olympus光學(xué)顯

8、微鏡下觀察大鼠肝臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　2.2大鼠血清中ALT活性的測定
　　大鼠血液未經(jīng)抗凝處理，3000rpm離心10min后分離血清，用血清ALT全自動生化分析儀測定其含量。
　　2.3大鼠血清中LDH活性的測定
　　大鼠血液LDH活性的測定，按照試劑盒的操作說明，采用LD-L速率法測定。
　　2.4大鼠心肌勻漿的制備以及MDA含量的測定
　　從-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注損傷組及對照組大

9、鼠的心肌組織，按照10mg/100μl的比例，加入4度勻漿緩沖液(PH7.4，磷酸鉀緩沖液50mmol/L，PMSF1mmol/L，鹽酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1％Tween-20，β-巰基乙醇5mmol/L，EDTANa31 mmol/L)，冰浴中勻漿，4℃勻漿液4000rpm離心20分鐘，取上清即制成10％心組織勻漿，心組織勻漿內(nèi)MDA含量經(jīng)南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.5大鼠心

10、肌PrxⅢ mRNA水平測定
　　用TRIzol法提取大鼠心肌RNA。將3μgRNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用GAPDH作為內(nèi)參照，進行RT-PCR。用PrxⅢ擴增產(chǎn)物的灰度值與GAPDH擴增產(chǎn)物的灰度值相比，表示目的基因PrxⅢ的相對表達量。
　　2.6大鼠心肌PrxⅢ蛋白水平測定
　　采用Western blotting的方法測定大鼠心肌內(nèi)PrxⅢ蛋白的相對表達量。將-80度冷凍的大鼠心肌組織制成勻漿液，離心后取上清。

11、用改良的Lowry法進行蛋白質(zhì)總量測定。兩組大鼠各心肌樣本蛋白上樣量為68ug。經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉處理后，在PVDF膜上加入一抗，室溫靜置過夜。洗膜后，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗。按照發(fā)光劑操作說明進行顯影、定影、晾干。對膠片進行掃描，并做圖像分析，以條帶的灰度值表示其蛋白含量，將PrxⅢ的灰度值與內(nèi)參照GAPDH的灰度值相比，所得即PrxⅢ蛋白的相對表達量。
　　結(jié)果:
　　1、大鼠肝臟形態(tài)學(xué)改變
　　在光學(xué)顯微鏡下可

12、見肝缺血再灌注損傷組大鼠的肝組織淤血嚴重，肝細胞受壓萎縮，肝血竇擴張充血明顯，肝細胞胞漿內(nèi)有空泡出現(xiàn)并且染色變淺，有部分肝細胞水腫，染色變淺，體積增大。對照組大鼠肝細胞排列整齊成條索狀，圍繞中央靜脈排列成放射狀，肝血竇無擴張充血大小均勻。
　　2、血清ALT水平
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06 U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0

13、.01)。
　　3、血清LDH水平
　　Con組大鼠血清中LDH為481.50±67.15U/L，而HIRI組血清LDH為658.83±94.15U/L。HIRI組大鼠血清LDH水平明顯高于Con組（P＜0.01）
　　4、心勻漿內(nèi)MDA的含量
　　Con組大鼠心肌組織MDA的含量為9.24±1.72mmol/g，而HIRI組MDA含量為12.73±1.84 mmol/g。HIRI組大鼠心肌組織MDA的含量明顯高

14、于Con組(P＜0.01)
　　5、大鼠心肌組織PrxⅢ mRNA相對表達量
　　大鼠心肌組織中抗氧化物酶--PrxⅢ mRNA的表達量采用RT-PCR的方法測定。計算與內(nèi)參照的比值得出相對表達量進行結(jié)果統(tǒng)計。分析表明:HIRI組大鼠心肌組織的PrxⅢmRNA水平均明顯高于Con組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠心肌組織內(nèi)PrxⅢ表達升高。
　　6、大鼠心肌組織中PrxⅢ蛋白相對表達量
　　采用Western

15、 blotting的方法測定大鼠心肌內(nèi)PrxⅢ蛋白的相對表達量。計算與內(nèi)參照的比值得出相對表達量進行結(jié)果統(tǒng)計。分析表明:HIRI組大鼠心肌中PrxⅢ蛋白的相對表達量（0.84±0.18）明顯高于對照組(0.58±-0.13)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、結(jié)扎肝右、中血管和膽管蒂可成功建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型。
　　2、大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型血清LDH和心肌組織MDA含量增加，提示:心肌組織已遭受過氧