萊菔硫烷對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷模型肝內(nèi)氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、腎缺血再灌注損傷（Renal ischemia reperfusion injury, RIRI）是泌尿外科手術(shù)治療腎臟疾病過(guò)程中常見(jiàn)的病理生理現(xiàn)象，多發(fā)生于腎擠壓傷、腎單位保留、腎臟移植等臨床治療過(guò)程中。腎臟在缺血過(guò)程及其后血液再灌注過(guò)程中，會(huì)有大量活性氧族（reac-tive oxygen species, ROS）產(chǎn)生,導(dǎo)致腎臟損傷。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是引發(fā)缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一。肝臟是人體內(nèi)重要的消化、分泌、解毒、排泄器

2、官。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)：腎缺血再灌注損傷發(fā)生后，肝臟也會(huì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)并遭受過(guò)氧化損傷。
　　核因子NF-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor2， Nrf2）是已發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Nrf2通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)。超氧化物歧化酶（Superoxide Dis

3、mutases，SOD）是機(jī)體內(nèi)主要的ROS清除酶系，同時(shí)SOD也接受Nrf2的調(diào)控，是其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因之一。萊菔硫烷（sulforaphane,SFN）是Nrf2通路的誘導(dǎo)劑，它可以通過(guò)上調(diào)Nrf2及受Nrf2轉(zhuǎn)錄調(diào)控的靶基因的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)作用。西蘭花等十字花科蔬菜中SFN的含量豐富。SFN能否通過(guò)抗氧化通路改善腎缺血再灌注所誘發(fā)的肝臟過(guò)氧化損傷未見(jiàn)報(bào)道。
　　本研究通過(guò)鉗夾左腎動(dòng)脈建立大鼠RIRI模型，RI

4、RI模型組大鼠給予SFN，觀察SFN處理的大鼠RIRI模型肝組織形態(tài)及功能變化、H2O2含量、MDA含量及抗氧化蛋白SOD活性及表達(dá)變化，探討SFN在防治RIRI誘發(fā)的肝臟過(guò)氧化損傷中發(fā)揮的抗氧化作用。
　　目的：通過(guò)觀察萊菔硫烷處理的大鼠RIRI模型肝組織形態(tài)學(xué)和功能變化，肝組織H2O2含量、MDA含量，肝組織抗氧化蛋白SOD活性及表達(dá)變化，探討RIRI發(fā)生后萊菔硫烷是否可通過(guò)上調(diào)Nrf2調(diào)控的基因SOD的表達(dá)，增強(qiáng)肝組織的RO

5、S清除作用，降低肝組織過(guò)氧化損傷程度，為萊菔硫烷對(duì)腎缺血再灌注所誘發(fā)肝組織損傷的防治研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。
　　方法：
　　1動(dòng)物模型建立及檢測(cè)標(biāo)本的處理
　　購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的雄性Wistar大鼠（體重200±10 g）24只，隨機(jī)分為對(duì)照組（Control組）、腎臟缺血再灌注損傷模型組（RIRI組）、缺血+萊菔硫烷組（SFN1組），灌注+萊菔硫烷組（SFN2組）。RIRI實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備：腹腔注射6％水合氯

6、醛（5ml／kg）麻醉大鼠。將RIRI組大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，酒精消毒后開(kāi)腹充分暴露雙側(cè)腎臟,先將大鼠的右側(cè)腎臟切除后,再鈍性地分離其左側(cè)腎動(dòng)脈,并采用無(wú)創(chuàng)傷性動(dòng)脈夾在接近腎門(mén)部位夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈，阻斷腎臟血液供應(yīng),此時(shí)可以觀察到腎臟顏色由鮮紅色迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榘导t色。血液灌注阻斷45分鐘后棄去動(dòng)脈夾,重新恢復(fù)左側(cè)腎臟的血液灌注,此時(shí)可見(jiàn)左側(cè)腎動(dòng)脈迅速充盈,腎臟顏色也隨即由暗紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r紅色,提示左側(cè)腎臟的血液重新灌注成功。Control組大鼠的

7、消毒開(kāi)腹過(guò)程與RIRI模型組一致，但該組大鼠雙側(cè)腎臟暴露后只切除其右側(cè)腎臟,鈍性地分離左側(cè)腎動(dòng)脈,但并不夾閉阻斷血液灌注。SFN1組大鼠在夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈后立即將二甲基亞砜稀釋的萊菔硫烷均勻涂抹于小腸表面，其余操作步驟同RIRI組。SFN2組大鼠在棄去血管夾恢復(fù)腎臟血液灌注后立即將二甲基亞砜稀釋的萊菔硫烷均勻涂抹于小腸表面，其余操作步驟同RIRI組。Control組和RIRI組只在小腸表面涂抹等量的二甲基亞砜。恢復(fù)大鼠腎臟血流灌注24小時(shí)

8、后重新麻醉大鼠，收集右頸總動(dòng)脈血液，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘,分離并收集血清，用于血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase, ALT）含量檢測(cè);大鼠處死后切取其肝臟，取適宜大小的肝臟標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定，用于HE染色法觀察大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)改變。將其余肝臟組織迅速置于液氮中，待冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于大鼠肝組織SOD活性、基因表達(dá)水平測(cè)定，丙二醛（malondialdehyde

9、，MDA）含量和過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）含量測(cè)定。
　　2檢測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法
　　2.1大鼠血清內(nèi)ALT含量檢測(cè)
　　采用微板法檢測(cè)大鼠血清ALT含量。ALT含量的測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.2大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的觀察
　　采用HE染色法觀察肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。將4%多聚甲醛固定的肝臟標(biāo)本按梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋處理后，將肝臟標(biāo)本切片厚度約

10、5μm，然后進(jìn)行蘇木精伊紅染色處理，采用奧林帕斯光學(xué)顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變并拍照。
　　2.3大鼠肝組織MDA含量檢測(cè)
　　肝組織MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.4大鼠肝組織H2O2含量檢測(cè)
　　肝組織H2O2含量采用鉬酸比色法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
　　2.5大鼠肝組織SOD活性檢測(cè)
　　肝組織SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，檢測(cè)過(guò)程

11、按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行
　　2.6大鼠肝組織SOD基因表達(dá)水平檢測(cè)
　　采用RNA提取試劑盒裂解提取大鼠肝組織內(nèi)的總RNA。RNA定量后將2μg RNA反轉(zhuǎn)錄成模板cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參照，進(jìn)行Real-Time PCR相對(duì)定量分析。
　　結(jié)果：
　　1大鼠肝組織的HE觀察結(jié)果
　　HE法觀察大

12、鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。光鏡下可見(jiàn)：Control組大鼠肝細(xì)胞大小均勻，圍繞中央靜脈排列成條索狀，肝血竇大小均勻未見(jiàn)異常；RIRI組大鼠：肝細(xì)胞萎縮體積變小，肝血竇擴(kuò)張。SFN1組大鼠：肝細(xì)胞腫脹體積增大，肝血竇被擠壓變窄，偶可見(jiàn)空泡變性；SFN2組大鼠：部分肝細(xì)胞萎縮，肝血竇略有擴(kuò)張，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)有大量空泡數(shù)量多于SFN1組。
　　2血清內(nèi)ALT含量的改變
　　與Control組大鼠血清內(nèi)ALT的含量（15.02±2.43

13、U/L）相比，RIRI組（210.27±29.94 U/L）、SFN2組（161.71±21.76 U/L）、SFN1組（111.25±17.94 U/L）大鼠血清ALT含量均明顯升高（P<0.05），但SFN2組和SFN1組大鼠血清ALT含量低于RIRI組（P<0.05），SFN1組大鼠血清ALT含量又低于SFN2組（P<0.05）。
　　3肝組織MDA含量的改變
　　與Control組大鼠肝組織MDA含量（45.08±6

14、.35 mmol/g）相比，RIRI組（96.49±12.38 mmol/g）、SFN2組（68.86±9.15 mmol/g）、SFN1組（54.62±9.57 mmol/g）大鼠肝組織MDA含量均升高（P<0.05），但SFN2組和SFN1組大鼠肝組織MDA含量低于RIRI組（P<0.05），SFN1組大鼠肝組織MDA含量又低于SFN2組（P<0.05）。
　　4肝組織H2O2含量的改變
　　與Control組大鼠肝組織

15、H2O2含量（55.49±8.75 mmol/g）相比，RIRI組（124.15±18.52 mmol/g）、SFN2組（96.09±12.14 mmol/g）、SFN1組（75.00±11.14 mmol/g）大鼠肝組織H2O2含量均升高（P<0.05），但SFN2組和SFN1組大鼠肝組織H2O2含量低于RIRI組（P<0.05），SFN1組大鼠肝組織H2O2含量又低于SFN2組（P<0.05）。
　　5大鼠肝組織SOD活性改變

16、
　　與Control組大鼠肝組織SOD活性（133.33±14.21 U/mg pro）相比， RIRI組（53.36±7.28 U/mg pro）、SFN2組（73.46±8.96 U/mg pro）、SFN1組（86.75±10.16 U/mg pro）大鼠肝組織SOD活性均降低（P<0.05），但SFN2組和SFN1組大鼠肝組織SOD活性高于RIRI組（P<0.05），SFN1組大鼠肝組織SOD活性又高于SFN2組（P<0

17、.05）。
　　6肝組織SOD基因的表達(dá)改變
　　Real-Time PCR法測(cè)定大鼠肝組織SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平， GAPDH作為擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照。與Control組大鼠肝組織SOD mRNA表達(dá)量（0.79±0.09）相比，RIRI組（0.99±0.15）、SFN2組（1.22±0.15）、SFN1組（1.31±0.13）大鼠肝組織SOD mRNA表達(dá)水平均升高（P<0.05）。SFN2組和SFN1組大鼠肝組織SOD的m

18、RNA相對(duì)表達(dá)水平又高于RIRI組（P<0.05），但SFN2組和SFN1組SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P﹥0.05）。此結(jié)果表明：在腎缺血再灌注損傷發(fā)生過(guò)程中，SFN上調(diào)了肝組織SOD基因表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后，萊菔硫烷通過(guò)上調(diào)肝組織Nrf2下游基因SOD的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)ROS的清除作用，降低了肝組織的過(guò)氧化損傷程度。
　　2與再灌注后給藥相比，缺血后即刻給予萊菔硫烷更能有