雞白痢沙門(mén)菌LPS合成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、雞白痢是由雞白痢沙門(mén)菌引起，各種日齡雞均可感染的一種急性或慢性傳染病，該病既可水平傳播又可垂直傳播，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展存在巨大威脅。國(guó)家動(dòng)物疫病長(zhǎng)期控制規(guī)劃中對(duì)種雞群提出凈化要求，如何有效減少沙門(mén)菌的帶菌率是目前亟待解決的問(wèn)題。疫苗免疫可有效地降低雞群的帶菌率，對(duì)種群的凈化具有積極作用。因此，研制安全、有效的基因缺失疫苗用于區(qū)別自然感染與疫苗免疫顯得尤為重要。關(guān)于沙門(mén)菌等革蘭氏陰性菌的研究表明，脂多糖不僅是合成外膜的重要組成部分，也是細(xì)

2、菌發(fā)揮毒力的重要因子。隨著人們對(duì)沙門(mén)菌的致病機(jī)理、毒力基因、脂多糖及疫苗應(yīng)用研究的不斷深入，通過(guò)基因工程方法制備減毒活疫苗已取得重大成就，并顯示出良好的應(yīng)用前景。
　　本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建雞白痢沙門(mén)菌LPS合成相關(guān)基因的缺失株，并對(duì)其相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià);其次，通過(guò)評(píng)價(jià)各沙門(mén)菌缺失株的毒力和免疫效力，為雞白痢沙門(mén)菌減毒活疫苗候選株的篩選奠定基礎(chǔ)。
　　1.雞白痢沙門(mén)菌LPS合成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建
　　根據(jù)

3、雞白痢沙門(mén)菌S6702株的LPS合成相關(guān)基因rfbA、rfaL、 rfaJ、rfaI、rfaG、rfaF設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增后利用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建雞白痢沙門(mén)菌缺失株S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL、S6702Δrfa、S6702ΔrfaI、S6702ΔrfaG和S6702ΔrfaF。通過(guò)PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定證實(shí)缺失株構(gòu)建成功。生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示，缺失株與野生株的生長(zhǎng)速率無(wú)顯著性差異。生物被膜形成能力測(cè)定顯示，與野生株相

4、比，S6702ΔrfaJ和S6702ΔrfaF的生物膜形成能力無(wú)顯著性差異，S6702ΔrfbA和S6702ΔrfaI的生物膜形成能力顯著增強(qiáng)，而S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG的生物膜形成能力顯著減弱。提取脂多糖進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明6株缺失株LPS的分子量相應(yīng)變小，顯示LPS的糖鏈合成受阻，進(jìn)一步證實(shí)缺失突變株構(gòu)建成功。
　　2.雞白痢沙門(mén)菌基因缺失株的致病性和免疫原性評(píng)價(jià)
　　通過(guò)肌肉接種2日齡SPF

5、雛雞，測(cè)定其半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果顯示野生株S6702的LD50為3.2×108CFU，缺失株S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL、S6702ΔrfaJ、 S6702ΔrfaI、S6702ΔrfaG和S6702ΔrfaF的LD50分別為＞1.5×109 CFU、＞1.5×109 CFU、1.4×109CFU、＞2.2×109 CFU、＞1.0×109 CFU、＞2.5×109 CFU，LD50結(jié)果說(shuō)明缺失株的致病力較野生株均

6、下降。免疫原性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，2日齡SPF雛雞免疫后S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG免疫組的體重與健康對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，S6702Δrfa、S6702ΔrfaI和S6702ΔrfaF免疫組的體重明顯下降。玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)野生株血清與S6702抗原產(chǎn)生凝集反應(yīng)，缺失株免疫血清與S6702抗原不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。利用間接ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體，免疫10天后IgG抗體水平較低。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)2日齡

7、SPF雛雞免疫后10天進(jìn)行野生株S004攻毒，缺失株均能提供完全保護(hù)。將缺失株免疫30日齡SPF雞，利用間接ELISA法檢測(cè)血清中抗體，結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后所有缺失株均可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體，玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)缺失株免疫血清無(wú)凝集抗體產(chǎn)生。因此，S6702ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔrfaG缺失株具有較好的免疫原性，且不產(chǎn)生凝集抗體。
　　3.雞白痢沙門(mén)菌基因缺失株的免疫效力試驗(yàn)
　　根據(jù)免疫保護(hù)評(píng)價(jià)篩選出S67

8、02ΔrfbA、S6702ΔrfaL和S6702ΔaG進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)，免疫后7、14和21天分別采集血清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，免疫后7天可檢測(cè)到陽(yáng)性抗體，第21天IgG抗體陽(yáng)性率接近100％。采集外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，免疫14天后S6702ΔrfaL免疫組的雞外周血內(nèi)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例上升，表明細(xì)胞免疫水平有所提高。疫苗組體內(nèi)分布試驗(yàn)表明，在免疫21天后，在雞肝臟和脾臟內(nèi)的缺失株細(xì)菌基本被清除。免疫保護(hù)試