RASSF6和miR-7-5p在人乳腺癌中的作用和機(jī)制.pdf

1、第一部分 RASSF6在人乳腺癌中的甲基化檢測(cè)及功能機(jī)制研究
　　目的：
　　1檢測(cè)RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員6(Ras association(RalGDS/AF-6) domain family member6,RASSF6)在人乳腺癌細(xì)胞株中及乳腺癌組織中的表達(dá)情況；
　　2檢測(cè)RASSF6啟動(dòng)子CpG島在人乳腺癌細(xì)胞株和人乳腺癌組織中甲基化情況；
　　3驗(yàn)證RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡

2、，細(xì)胞遷移侵襲方面的調(diào)控作用；
　　4探討介導(dǎo)RASSF6抑癌作用相關(guān)的信號(hào)通路改變。
　　方法：
　　1采用RT-PCR檢測(cè)RASSF6在人正常組織、人乳腺癌細(xì)胞株和人正常乳腺組織中的表達(dá)情況；采用Western blot檢測(cè)RASSF6在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況；采用Real-time PCR檢測(cè)RASSF6在人乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況；分析 Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)庫中，RASSF6在人乳腺癌正常

3、組織及癌組織中的表達(dá)情況。
　　2使用甲基化特異性PCR（Methylation-specific PCR，MSP）檢測(cè) RASSF6在人乳腺癌細(xì)胞株和人乳腺癌組織中的啟動(dòng)子甲基化情況；使用BGS檢測(cè)＃115號(hào)乳腺癌樣本中RASSF6啟動(dòng)子甲基化情況。
　　3體外實(shí)驗(yàn)中，使用平板克隆實(shí)驗(yàn)，軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)，CCK-8實(shí)驗(yàn)， EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用。
　　4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用裸鼠成瘤實(shí)

4、驗(yàn)驗(yàn)證RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用。
　　5采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的調(diào)控作用，并采用Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)p21和p27的調(diào)控作用。
　　6采用AO/EB染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并用Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3， cleaved-caspase7，cleaved-caspase9，clea

5、ved-PARP的變化。
　　7采用劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell小室檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用；采用 Transwell小室檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控作用；采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)S100A4，MMP2的調(diào)節(jié)作用。
　　8采用Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　1 RASS

6、F6在人正常組織和人正常乳腺組織中廣泛表達(dá)；而在人乳腺癌細(xì)胞株中，多個(gè)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)或缺失，包括 BT549和MDA-MB-231等三陰性乳腺癌細(xì)胞株；相對(duì)于人乳腺癌旁組織， RASSF6在人乳腺癌組織的表達(dá)顯著下調(diào)。
　　2 RASSF6在 BT549和MDA-MB-231細(xì)胞株中檢測(cè)到甲基化，在人乳腺癌組織中檢測(cè)到廣泛甲基化。
　　3體外實(shí)驗(yàn)中，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示RASSF6可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞的克

7、隆形成能力；CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示出 RASSF6抑制增殖的能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中， RASSF6可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)速度。
　　4流式細(xì)胞結(jié)果顯示RASSF6可顯著抑制G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，且顯著上調(diào)p21；AO/EB染色和流式細(xì)胞結(jié)果顯示RASSF6可誘導(dǎo)人乳腺癌凋亡，且caspase3，caspase7，caspase9，PARP發(fā)生剪切。
　　5劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell實(shí)驗(yàn)顯示RASSF6可顯著抑制人

8、乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，且顯著下調(diào)S100A4和MMP2的表達(dá)。
　　6Western blot結(jié)果顯示RASSF6可顯著下調(diào)Akt的磷酸化水平，而Akt為S100A4和MMP2的上游信號(hào)通路。
　　結(jié)論：
　　1 RASSF6由于啟動(dòng)子 DNA甲基化導(dǎo)致其在人乳腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。
　　2 RASSF6通過抑制Akt信號(hào)通路調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。
　　第二部分 miR-7-5

9、p靶向REGγ抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖
　　目的：
　　1驗(yàn)證敲減 miR-7-5p對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用以及對(duì) REGγ表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。
　　2驗(yàn)證REGγ是否會(huì)逆轉(zhuǎn)miR-7-5p抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖功能。
　　3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-7-5p抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　方法：
　　1使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-7-5p抑制劑抑制miR-7-5p的表達(dá)，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以及使用Weste

10、rn blot檢測(cè)REGγ蛋白水平變化；并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變。
　　2共轉(zhuǎn)染 miR-7-5p和REGγ，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以及采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變。
　　3使用過表達(dá) RASSF6的細(xì)胞株以及對(duì)照細(xì)胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型；測(cè)量移植瘤的體積和重量；且使用免疫組化檢測(cè)Ki-67和REGγ的變化。
　　4提取 Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證在同樣的乳腺癌組織中miR-7-5p和RE

11、Gγ之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1敲減miR-7-5p可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，且REGγ蛋白水平有顯著上調(diào)。
　　2 REGγ可部分逆轉(zhuǎn)miR-7-5p的抑增殖功能，細(xì)胞周期結(jié)果顯示出相同的變化。
　　3移植瘤構(gòu)建成功，miR-7-5p可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)；移植瘤切片顯示增殖相關(guān)基因Ki-67顯著下調(diào)及REGγ蛋白水平顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1 miR-7-