CIP2A在genistein和lapatinib抗乳腺癌中的作用.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 Genistein作用乳腺癌細(xì)胞后CIP2A表達(dá)變化
　　目的：
　　檢測(cè)genistein作用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D后CIP2A的蛋白水平表達(dá)，以及genistein對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡活動(dòng)的影響。
　　方法：
　　1.選用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Caspase3穩(wěn)定表達(dá)的MCF-7/ Caspase3（MCF-7-C3）細(xì)胞株，We

2、stern blot檢測(cè)經(jīng)不同濃度genistein處理后乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A、PARP/cleaved PARP、caspase-3、cleaved caspase-3的表達(dá)水平變化。
　　2.采用 MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度 genistein(0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，60μM)對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D增殖的影響。
　　3.用流式細(xì)胞儀分析g

3、enistein處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D前后對(duì)細(xì)胞周期分布的影響。
　　結(jié)果：
　　1.Genistein對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A蛋白表達(dá)有下調(diào)的作用，且隨著genistein濃度的升高，對(duì)CIP2A蛋白的下調(diào)作用增強(qiáng);通過(guò)western blot檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)水平顯示，genistein可以引起明顯的凋亡活動(dòng)，減少總caspase-3蛋白水平的表達(dá)，增加caspas

4、e-3和PARP的切割帶產(chǎn)生。提示genistein誘導(dǎo)的CIP2A下調(diào)與總caspase-3水平的下降、caspase-3和PARP的切割帶升高有關(guān)，即genistein介導(dǎo)的CIP2A蛋白水平的下調(diào)與其誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡活動(dòng)有關(guān)。
　　2.MTT結(jié)果顯示，genisten（＞10μM）對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D有生長(zhǎng)抑制作用，且呈濃度依賴(lài)性。
　　結(jié)論：
　　Genistein可以下調(diào)癌基因CIP2A

5、的蛋白表達(dá)，其介導(dǎo)的CIP2A下調(diào)活動(dòng)可能與genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡活動(dòng)發(fā)生有關(guān)。
　　第二部分 CIP2A過(guò)表達(dá)減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)genistein的敏感性
　　目的：
　　為了研究CIP2A過(guò)表達(dá)是否減弱乳腺癌細(xì)胞對(duì)genistein的藥物敏感性，即CIP2A過(guò)表達(dá)減弱genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活動(dòng)和凋亡的發(fā)生。
　　方法：
　　1.用CIP2A過(guò)表達(dá)編碼的慢病毒分

6、別感染乳腺癌細(xì)胞株MCF-7-C3和T47D,對(duì)照組感染空載質(zhì)粒。經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定混合克隆細(xì)胞株，經(jīng)Western blot檢測(cè)，對(duì)各個(gè)穩(wěn)定克隆細(xì)胞株CIP2A蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行鑒定。
　　2.MTT檢測(cè)genistein對(duì)穩(wěn)定克隆細(xì)胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對(duì)照組細(xì)胞增殖的影響。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)genistein對(duì)穩(wěn)定克隆細(xì)胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對(duì)

7、照組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過(guò)篩選和Western blot鑒定，獲得穩(wěn)定CIP2A過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7-C3和T47D，分別命名為MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A細(xì)胞。
　　2.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細(xì)胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A經(jīng)過(guò)genistein不同濃度(0μM，5.μM，10μM，20μM，40μM，60μM)處理5

8、天后，與各自的對(duì)照組細(xì)胞相比，genistein對(duì)CIP2A過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的生長(zhǎng)抑制作用明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　CIP2A過(guò)表達(dá)減弱genistein介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡活動(dòng)的發(fā)生。
　　第三部分 CIP2A沉默促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對(duì)genistein的敏感性
　　目的：
　　為了研究CIP2A沉默是否增加genistein的藥物敏感性，即CIP2

9、A沉默增強(qiáng)genistein誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡的發(fā)生。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)中采用CIP2A shRNA編碼的慢病毒感染MCF-7-C3和T47D細(xì)胞，對(duì)照組感染空載質(zhì)粒。Western blot檢測(cè)篩選后的穩(wěn)定克隆細(xì)胞株在CIP2A蛋白水平的表達(dá)。
　　2.MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細(xì)胞株MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A經(jīng)過(guò)genistein不同濃度處理5天后，與各

10、自對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比，genistein對(duì)MCF-7-C3/siCIP2A、T47D/siCIP2A乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用增加。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過(guò)puromyein篩選和Western blot鑒定，獲得穩(wěn)定CIP2A沉默細(xì)胞株MCF-7-C3和T47D，分別命名為MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A。
　　2.MTT比色分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定克隆細(xì)胞MCF-7-C3/siCIP2A、T47D

11、/siCIP2A經(jīng)genistein處理5天后，與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組相比，genistein促進(jìn)了CIP2A沉默細(xì)胞株MCF-7-C3/siCIP2A和T47D/siCIP2A的生長(zhǎng)抑制。
　　結(jié)論：
　　CIP2A沉默的乳腺癌細(xì)胞增加了genistein介導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡活動(dòng)的發(fā)生。
　　第四部分 Genistein誘導(dǎo)CIP2A下調(diào)的分子機(jī)制
　　目的：
　　從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白酶體通路水平探討gen

12、istein下調(diào)CIP2A的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.Genistein處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析genistein對(duì)乳腺癌細(xì)胞的CIP2A mRNA水平的調(diào)節(jié)。
　　2.Genistein處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D細(xì)胞后，合并或不合并蛋白酶體抑制劑MG132繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后采用Western blot分析對(duì)CIP2A蛋白表達(dá)水平的影響。
　

13、　3.由于CIP2A蛋白的穩(wěn)定性受到Akt活性的調(diào)節(jié)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用genistein處理乳腺癌細(xì)胞后，采用Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D在p-Akt的蛋白水平變化;E2F1是調(diào)控CIP2A轉(zhuǎn)錄水平變化的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，在實(shí)驗(yàn)中我們用genistein處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D后，用Western blot檢測(cè)了E2F1的蛋白表達(dá)水平變化，旨在研究E2F1在genistein介導(dǎo)的CIP

14、2A轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在乳腺癌細(xì)胞MCF-7-C3和T47D中用25μM或50μM genistein處理過(guò)后的CIP2A的mRNA水平明顯下降;且在低濃度的genistein處理后的乳腺癌細(xì)胞中CIP2A的mRNA水平有了輕度的升高。這種劑量依賴(lài)式模式變化與我們前面研究的genistein對(duì)CIP2A在蛋白水平變化相一致。
　　2.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)

15、經(jīng)過(guò)用蛋白酶抑制劑MG132處理后的細(xì)胞可以明顯逆轉(zhuǎn)genistein所誘導(dǎo)的CIP2A在蛋白水平的下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　Genistein誘導(dǎo)的CIP2A轉(zhuǎn)錄水平的抑制與CIP2A的蛋白水平下調(diào)有關(guān)且受到蛋白酶體通路的調(diào)節(jié);genistein誘導(dǎo)的CIP2A在蛋白水平發(fā)生的下調(diào)導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中Akt的活性受到抑制;轉(zhuǎn)錄因子E2F1在genistein誘導(dǎo)的CIP2AmRNA水平下調(diào)中起關(guān)鍵作用，這一變化導(dǎo)致了整個(gè)CIP2

16、A在蛋白水平的下調(diào)。
　　第五部分 CIP2A調(diào)節(jié)在lapatinib耐藥細(xì)胞中的作用
　　目的：
　　檢測(cè)CIP2A沉默后BT474/LR細(xì)胞對(duì)lapatinib的敏感性變化，探討CIP2A在lapatinib耐藥性(LR)乳腺癌細(xì)胞中的作用，
　　方法：
　　1.采用本實(shí)驗(yàn)室已建好的lapatinib耐藥細(xì)胞株BT474/LR，用MTT比色分析驗(yàn)證BT474和BT474/LR乳腺癌細(xì)胞對(duì)lapatini

17、b的不同敏感性。
　　2.分析lapatinib對(duì)乳腺癌細(xì)胞BT474和BT474/LR中CIP2A蛋白表達(dá)水平的影響。
　　3.以CIP2A shRNA編碼的慢病毒感染BT47/LR細(xì)胞，篩選和建立有效CIP2A沉默的穩(wěn)定克隆細(xì)胞株BT474/LR/siCIP2A。
　　結(jié)果：
　　1.用lapatinib處理乳腺癌細(xì)胞BT474和BT474/LR后，MTT比色分析結(jié)果顯示BT474/LR細(xì)胞對(duì)抗lapatin

18、ib誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，BT474和BT474/LR細(xì)胞經(jīng)lapatinib處理后，BT474/LR細(xì)胞對(duì)抗lapatinib誘導(dǎo)CIP2A下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　CIP2A沉默增強(qiáng)BT474/LR細(xì)胞株對(duì)lapatinib的敏感性，也增加lapatinib誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制和凋亡活動(dòng)，其誘導(dǎo)機(jī)制可能與CIP2A沉默后增加lapatinib對(duì)BT474/LR細(xì)胞中Akt活性的抑制相關(guān)