應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對沙門菌快速鑒定及血清型分型方法與廣州市腹瀉患者沙門菌耐藥表型和分子分型研究.pdf

1、沙門菌引起的感染性疾病是一個世界性的健康難題。沙門菌的感染主要來自于被污染的食物和水源，可以引起人類和動物多種疾病，輕者為自愈性胃腸炎，重者可引起致死性傷寒，其引起的疾病主要包括以下幾種:胃腸炎、菌血癥或敗血癥、傷寒和副傷寒。沙門菌引起的最常見的疾病是自愈性胃腸炎，其引起的發(fā)熱在2天之內(nèi)，而腹瀉的持續(xù)時間不超過7天。傷寒的典型癥狀是發(fā)熱、頭痛、腹瀉、腹痛并可引起呼吸系統(tǒng)、肝脾和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥。
　　沙門菌為具有鞭毛的革

2、蘭陰性桿菌，其抗原結(jié)構(gòu)主要有3種，即菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原及表面抗原（Vi抗原等），當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)58種O抗原和114種H抗原。根據(jù)沙門菌的O抗原和H抗原的不同，參考Kauffmann-White分型方案，已有超過2500種血清型被發(fā)現(xiàn)。不同血清型的沙門菌引起的疾病類型會有所不同，腸熱癥主要由傷寒沙門菌和副傷寒沙門菌引起，菌血癥或敗血癥則多數(shù)以豬霍亂沙門菌的感染為主。另外，在沙門菌引起的食源性疾病暴發(fā)流行中，往往由一種或某幾種血清型

3、的沙門菌引發(fā)的感染，可根據(jù)具體的血清型進(jìn)行溯源，及早發(fā)現(xiàn)疾病暴發(fā)流行的源頭，阻止其繼續(xù)傳播。因此，對沙門菌血清型進(jìn)行準(zhǔn)確快速分型，有助于臨床上對沙門菌病的診斷和治療，有助于沙門菌引起的爆發(fā)流行中的調(diào)查研究與控制，并且可用于監(jiān)控每種血清型的變化趨勢。
　　基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix assisted laserdesorption/ionization time of flight mass spectromet

4、ry, MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，主要是對微生物中的特異性核糖體蛋白進(jìn)行軟電離，形成特定的蛋白指紋圖譜，與已建立好的各種微生物的蛋白指紋圖譜庫進(jìn)行匹配，從而快速獲得鑒定結(jié)果。MALDI-TOF MS操作簡便，檢測快速準(zhǔn)確，并且具有高通量檢測的優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于臨床微生物的病原診斷。
　　液相懸浮芯片技術(shù)是一種多功能的液相分析平臺，許多反應(yīng)均發(fā)生于懸浮于液相中的微球表面，因而得名，也被稱為

5、xMAP(flexible multi-analyte profiling)、液相芯片或者懸浮陣列。xMAP將高通量的生物芯片技術(shù)，激光技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、及應(yīng)用流體學(xué)等技術(shù)結(jié)合在一起，是一種新型的高通量的芯片檢測平臺，利用懸浮在液相中的分類編碼微球作為檢測載體，具有高通量、快速、靈敏度和特異性強及檢測范圍廣的優(yōu)點。針對沙門氏菌的各種O和H抗原的目的基因片段設(shè)計特異性引物，并且設(shè)計相對應(yīng)的特異探針，經(jīng)多重PCR后，偶聯(lián)有各種探針的微球與P

6、CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，然后進(jìn)行熒光信號檢測，從而確定被檢測沙門菌相對應(yīng)的O和H抗原。美國Luminex公司最近開發(fā)了Luminex xMAP(@)Salmonella Serotyping Assay(xMAP SSA)試劑盒，可以對沙門菌的血清型進(jìn)行快速鑒定。該試劑盒在國內(nèi)外的應(yīng)用尚處于探索階段，在國內(nèi)未見相關(guān)報道。
　　本研究包括以下兩個部分:
　　一、應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對沙門菌快速鑒

7、定及血清型分型方法
　　沙門菌的血清型鑒定長期以來依靠傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，傳統(tǒng)的血清學(xué)方法需要生產(chǎn)上百種抗血清，并且這些抗血清的生產(chǎn)和使用過程均要進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究應(yīng)用MALDI-TOF MS和液相懸浮芯片技術(shù)建立一種對沙門菌快速鑒定及血清型分型方法，并且評價該方法對沙門菌鑒定與血清型分型的效能，以及其在中國南方地區(qū)的應(yīng)用價值。收集205株來源于中國南方地區(qū)的沙門菌，利用微生物自動生化鑒定系統(tǒng)—Vitek2和MALDI-TOF M

8、S在屬的水平上鑒定沙門菌，然后應(yīng)用液相懸浮芯片技術(shù)—xMAP SSA和傳統(tǒng)分型方法同時檢測沙門菌的血清型。對于xMAP SSA和傳統(tǒng)血清學(xué)方法檢測不一致血清型的結(jié)果，則對相關(guān)fljB基因和fliC基因進(jìn)行PCR和測序分析，進(jìn)一步判斷哪種方法檢測的結(jié)果是準(zhǔn)確的。MALDI-TOF MS在鑒定沙門菌菌屬時，與Vitek2的檢測結(jié)果完全一致，所有菌株均能準(zhǔn)確鑒定到沙門菌菌屬。Vitek2對每個沙門菌菌菌株的鑒定所消耗的時間平均需要5個小時，而

9、MALDI-TOF MS僅需要5分鐘左右的時間就可以輸出鑒定結(jié)果。MALDI-TOF MS可以直接鑒定生長在選擇性平板上的沙門菌，而Vitek2卻不能。205株沙門菌中共有40種血清型，數(shù)量最多的前5種血清型分別為腸炎沙門菌(Enteritidis)(n=42，20.49％)，斯坦利沙門菌(Stanley)(n=32，15.61％)，Ⅰ4，5，12:i:-(n=29，14.15％)，鼠傷寒沙門菌（typhimurimum）(n=24，1

10、1.71％)、德爾卑沙門菌(Derby)(n=9，4.39％)。對205株沙門菌血清型的鑒定中，195株沙門菌的血清型可以被xMAP SSA完全鑒定，有10(4.87％)個菌株的血清型部分的O抗原或者H抗原由于超出本方法的檢測范圍不能被完全鑒定，xMAP SSA準(zhǔn)確鑒定195株沙門菌中的192株沙門菌的血清型(98.5％，192/195)，其中僅錯誤鑒定3株沙門菌的H抗原。傳統(tǒng)法對5個沒有動力的沙門菌菌株和3個單相型沙門菌菌株均沒有完整

11、鑒定出其血清型，但是xMAP SSA可以鑒定出完整的血清型。xMAP SSA不需要相位誘導(dǎo)，且可以進(jìn)行自動化大批量檢測。結(jié)合MALDI-TOF MS和xMAP SSA這兩種新發(fā)展的技術(shù)，從沙門菌菌屬的鑒定到血清型結(jié)果的檢測過程比常用的Vitek2結(jié)合傳統(tǒng)血清學(xué)方法平均可節(jié)約79個小時，前者檢測一個沙門菌菌株的血清型平均成本費用只是Vitek2結(jié)合傳統(tǒng)血清學(xué)方法的1/3左右。MALDI-TOF MS結(jié)合xMAP SSA鑒定沙門菌血清型的準(zhǔn)

12、確率高達(dá)98.5％。 MALDI-TOF結(jié)合xMAP SSA的方法鑒定沙門菌血清型具有準(zhǔn)確，快速，高通量和低成本的優(yōu)點。該方法將會極大地增強臨床和公共衛(wèi)生健康部門對沙門菌血清型分型的能力，十分有助于本地區(qū)對沙門菌血清型快速鑒定和監(jiān)測，并且適用于中國南方地區(qū)。
　　二、2013年1月～2014年5月廣州市腹瀉患者沙門菌耐藥表型、PFGE和MALDI-TOF MS分型研究
　　沙門菌是引起食源性疾病的主要病原體之一，可以對人類和

13、動物致病。多年以來，在廣州市發(fā)生食物中毒的事件中，沙門菌一直占前四位?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time ofFlight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，不僅應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的快速鑒定，也逐漸探索其在細(xì)菌的種的水平上分型中的應(yīng)用。為了研究廣州市2013年1月～2014年

14、5月腹瀉患者感染的沙門菌的血清型分布、耐藥情況以及PFGE的分型特征，并且研究MALDI-TOFMS在沙門菌分型中的應(yīng)用，本研究利用傳統(tǒng)血清學(xué)方法鑒定沙門菌的血清型，用紙片擴(kuò)散法(KB法)進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗。同時，對82株斯坦利沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和Ⅰ4，5，12:i:-四種血清型的沙門菌，應(yīng)用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和MALDI-TOF MS進(jìn)行分型研究。從2013年1月至2014年5月，179株廣州市腹瀉患者沙門菌

15、的臨床分離株被鑒定為38種血清型，數(shù)量居前四位的血清型為腸炎沙門茵(21.2％)、斯坦利沙門菌(17.3％)、Ⅰ4，5，12:i:-沙門菌(16.2％)和鼠傷寒沙門菌(10.1％)。所有沙門菌菌株對萘啶酸、呋喃妥因、四環(huán)素、氨芐西林耐藥率最高，分別達(dá)到44.7％，42.5％，39.7％和35.8％，對環(huán)丙沙星的敏感率僅為20.7％;對頭孢他啶、頭孢噻肟和頭孢曲松的耐藥率均為7.3％，9.5％和9.5％，對頭孢吡肟的耐藥率為7.3％。對三

16、類及以上抗生素耐藥的多重耐藥菌有72(40.2％)株。116株四種常見血清型斯坦利沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和Ⅰ4，5，12:i:-沙門菌的多重耐藥菌株共有54株，占46.6％。傷寒沙門菌有2株，但是均沒有對環(huán)丙沙星和頭孢類藥物表現(xiàn)耐藥。不同血清型的沙門菌表現(xiàn)出不同的耐藥情況。以相似度90％以上判定為同一型別，27株斯坦利沙門菌、21株腸炎沙門菌、21株鼠傷寒沙門菌和13株Ⅰ4，5，12:i:-沙門菌分別可分為13、10、11、1

17、0個PFGE型與26、20、21、13個MS型。以相似度100％為同一PFGE型，27株斯坦利沙門菌、21株腸炎沙門菌、21株鼠傷寒沙門菌和13株Ⅰ4，5，12:i:-沙門菌分別可分為25、15、17和13個PFGE型。從2013年至2014年，在廣州市年引起腹瀉的沙門菌主要以斯坦利沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌和Ⅰ4，5，12:i:-沙門菌為主，分成多種PFGE型，呈高度散發(fā)的態(tài)勢。本地區(qū)沙門菌菌株的多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對于氟喹諾酮類