基于抗原抗體反應(yīng)持牛源A型多殺性巴氏桿菌保護(hù)性抗原的篩選及鑒定.pdf

1、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是造成牛出血性敗血病，羊敗血病或肺炎，鳥類禽霍亂，豬萎縮性鼻炎，兔膿血癥等多種動物疾病的原因，給世界各地的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，預(yù)防和控制巴氏桿菌病的疫苗有弱毒苗和滅活苗，但由于巴氏桿菌血清型較多，不同菌株間缺乏相應(yīng)的交叉保護(hù)，且疫苗保護(hù)期較短等原因，該病仍未得到有效的控制。2008年以來，我國一些省份相繼檢測出牛源A型多殺性巴氏桿菌，它主要引起牛肺炎。由于現(xiàn)有

2、疫苗株均為B型巴氏桿菌，還沒有針對A型多殺性巴氏桿菌的疫苗，因此，人們希望研究出一種能對多種巴氏桿菌血清型菌株提供交叉保護(hù)且有安全保證的新型疫苗。
　　伴隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們對疫苗的研究進(jìn)入了一個新的時期?，F(xiàn)在，已經(jīng)越來越多的病原微生物完成了全基因組序列的測序，這就為利用反向疫苗學(xué)研發(fā)各種新型疫苗提供了數(shù)據(jù)平臺。以研究基因組序列為基礎(chǔ)的“反向疫苗學(xué)”已經(jīng)越來越多地應(yīng)用到新型疫苗的研發(fā)中，逐漸成為一條新的疫

3、苗研制途徑。反向疫苗學(xué)通過對病原生物的基因組序列分析，預(yù)測出潛在的具有免疫原性的候選抗原，不必進(jìn)行大量病原微生物培養(yǎng)，即可通過高通量表達(dá)，利用蛋白免疫印跡或間接ELISA等免疫學(xué)方法分析、篩選和鑒定出特異性抗原，并在小鼠模型中檢測候選抗原的免疫保護(hù)性，從而篩選出具有保護(hù)性的抗原，作為疫苗的免疫抗原，為研制有效的疫苗提供理論依據(jù)。這不僅提高了候選疫苗的篩選成功率，同時還有助于預(yù)測和發(fā)現(xiàn)以往所不知的各種免疫原，具有十分重要和深遠(yuǎn)的意義。

4、r>　　按照反向疫苗學(xué)的思路，本研究所做的具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、牛源A型多殺性巴氏桿菌保護(hù)性抗原的初步篩選及克隆表達(dá)
　　本實驗室前期已經(jīng)完成對牛源A型多殺性巴氏桿菌CQ2株的全基因組測序和分析，預(yù)測其編碼的基因并注釋編碼的功能蛋白，構(gòu)建了PmCQ2株全基因組序列本地數(shù)據(jù)庫。本研究就是利用反向疫苗學(xué)的思想，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，如在線分析工具SignalR-3.0 server、SMART、TMHMM Server

5、 v.2.0對PmCQ2的部分蛋白進(jìn)行分析，篩選出具有信號肽或跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白作為保護(hù)性抗原候選分子，最終篩選出56個保護(hù)性抗原候選基因。將抗原候選基因分別設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR克隆，進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后，與同樣進(jìn)行雙酶切反應(yīng)的原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接構(gòu)建重組載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE分析，56個重組目標(biāo)蛋白均成功在大腸桿菌中實現(xiàn)表達(dá)。
　　2、牛源巴氏桿菌保護(hù)性抗原候選分子

6、的間接ELISA方法篩選
　　將56個重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，用Ni柱對融合蛋白進(jìn)行純化。本實驗室前期工作已經(jīng)完成了對牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株的36個推定蛋白克隆表達(dá)和純化，將這92個純化后蛋白經(jīng)透析復(fù)性后包被酶聯(lián)板，利用4種牛血清:A型人工感染血清、A型滅活苗免疫血清、B型人工感染血清和F型人工感染血清，按照間接ELISA方法來篩選具有良好反應(yīng)原性的蛋白。最終篩選出只能與A型血清反應(yīng)而不與B、F型血清反應(yīng)的P

7、mA型特異蛋白2個;只與A型人工感染血清反應(yīng)，不與A型滅活苗血清反應(yīng)的PmA型差異蛋白13個;均能與A型、B型和F型反應(yīng)的共有蛋白20個。
　　3、部分保護(hù)性抗原候選分子對小鼠的免疫保護(hù)性研究
　　為了驗證所篩選部分蛋白對免疫動物的保護(hù)力，本研究以小鼠為模型，將PmA型、PmB型和PmF型共有蛋白2個(1，L17)和PmA型差異蛋白2個(11，L16)用弗氏佐劑乳化后，分別皮下免疫小鼠。檢驗四種蛋白對A型巴氏桿菌的保護(hù)力時，

8、免疫劑量設(shè)置兩個梯度，實驗組1每只小鼠免疫50μg，實驗組2每只小鼠免疫75μg，三免后第10天以3LD50劑量攻毒牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種蛋白對PmCQ2株抵抗力都很高，可達(dá)50％以上;75μg高免疫劑量與50μg低免疫劑量相比，11號蛋白的免疫保護(hù)率明顯提高，由原來的70％上升到90％。檢驗四種蛋白對B型和F型巴氏桿菌保護(hù)性時，每只小鼠免疫劑量均為75μg，三免后分別3LD50劑量攻毒B型和F型巴氏桿菌，結(jié)果

9、發(fā)現(xiàn)，1號，11號，L17號蛋白對B型均有較高的保護(hù)性，但對F型巴氏桿菌保護(hù)性較低。而L16號蛋白對B型、F型的免疫保護(hù)性均較低，這個結(jié)果也與間接ELISA實驗相吻合。
　　綜上所述，本研究利用反向疫苗學(xué)所篩選了92個保護(hù)性抗原候選分子，并經(jīng)間接ELISA篩選后，在小鼠模型中驗證其免疫保護(hù)力，結(jié)果證實，蛋白1號，11號，L17號三種蛋白在小鼠模型中，能夠提供對A型、B型巴氏桿菌較高的交叉保護(hù)性，提示可以作為牛源多殺性巴氏桿菌有效的