PAI-1SRNA對博來霉素致大鼠肺纖維化的影響及其作用機(jī)制探討.pdf

1、肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)的本質(zhì)是慢性的、致命性的纖維紊亂，其后期可合并造成肺泡壁的增厚以及肺泡間隔的消失，最終導(dǎo)致肺功能喪失為特征的疾病，其主要表現(xiàn)在成纖維細(xì)胞的增生異常以及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中膠原的過度沉積。IPF的主要病理特征包括細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積、間質(zhì)細(xì)胞的增殖以及肺組織結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。在肺纖維化形成過程當(dāng)中，細(xì)胞因子作用活躍，它們之間

2、可以相互作用，也可以通過與多種炎癥介質(zhì)及其與肺臟組織細(xì)胞互相影響，產(chǎn)生復(fù)雜的反應(yīng)，導(dǎo)致肺組織的炎癥加劇，同時纖維母細(xì)胞的活動受到刺激，進(jìn)而增殖增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。研究發(fā)現(xiàn)，有兩種降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類即:纖溶酶(plasmin)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPS)。纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活抑制物(plasminogen activator/plasminogen activato

3、r inhibitor，PAs/PAIs)和基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(the inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)的活性與表達(dá)異常在ECM的降解中發(fā)揮重要的作用。
　　纖溶酶原是纖溶系統(tǒng)中的重要酶，它可以由纖溶酶原激活劑激活，轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶一方面發(fā)揮著纖溶作用，另一方面參與體內(nèi)許多病理、生理過程，如炎癥、腫瘤發(fā)生、組織重建等，而這些過程是和蛋白質(zhì)的水解有關(guān)系的[1]。纖溶酶

4、原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是一種尿激酶型纖維蛋白酶原(urokinase type plasminogenactivator，u-PA)的特異而主要抑制劑，亦是血管損傷、血栓形成部位纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)劑[2]。動物模型已經(jīng)證實，PAI-1基因在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠體內(nèi)過度表達(dá)可以加重肺纖維化。在ECM合成和降解代謝中，基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子兩

5、大酶系統(tǒng)能否維持平衡有著重要的作用，MMPs可以降解ECM，TIMPs是MMPs的重要抑制物，TIMPs可以促進(jìn)膠原的沉積，使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少。近年來在IPF患者中發(fā)現(xiàn)，TIMPS的表達(dá)量較MMPS占有明顯優(yōu)勢，從而促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展。
　　RNA干擾(RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)被認(rèn)為是生物學(xué)中的創(chuàng)舉之作，小分子RNA(SiRNA)技術(shù)是一種新型基因技術(shù)，它以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后為目的，通過合成小分子RNA，對靶基因?qū)崿F(xiàn)特異性抑制，

6、RNA干擾因其操作簡便，效率較高的抑制目的基因的表達(dá)，易于調(diào)節(jié)控制等優(yōu)點，已成為基因功能研究以及治療的一種新靶點。
　　目的:
　　本研究中，我們通過對博萊霉素所致肺纖維化大鼠模型氣管內(nèi)注入PAI-1siRNA，首先測定肺泡灌洗液中PAI-1活性，進(jìn)一步利用RT-PCR方法測定α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅲ型膠原(collagen typeⅢ)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)，轉(zhuǎn)換生長因子-β(TGF-β)的表

7、達(dá)情況，初步探討PAI-1是否參與了調(diào)節(jié)肺纖維化過程，以便進(jìn)一步研究PAI-1siRNA對肺纖維化的治療作用及機(jī)制。
　　方法:
　　選取Wistar清潔級雄性大鼠72只，體重（140±20）g，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法把實驗動物分成4組，鹽水組(Sham組)、博萊霉素組（B組）、BLM+PAI-1SiRNA組（B+P組）和BLM+SiRNA陰對組（B+N組），每組各18只。使用無水乙醚局部麻醉，采取仰臥位固定，常規(guī)消毒皮膚，行頸正

8、中切口，分離組織，暴露氣管，B組、B+P組和B+N組按5 mg/kg抽取BLM液0.2～0.3 mL(生理鹽水溶解)，穿刺并注入氣管內(nèi)，Sham組注入0.2～0.3mL等體積生理鹽水。造模成功后，每周2次氣管內(nèi)給藥，4周共給藥8次，B+P組每周兩次氣管內(nèi)注入DEPC水溶解的PAI-1SiRNA（7.5nmol，0.2ml高壓過的去離子水溶），B+N組每周兩次氣管內(nèi)注入等量非特異的SiRNA（7.5nmol，0.2ml高壓過的去離子水溶）

9、，Sham組和B組每周兩次氣管內(nèi)注入0.2ml的生理鹽水。上述4組動物分別于第7、14、28天每組各處死6只。左肺行肺泡灌洗測定PAI-1活性，右中葉組織儲存于-80℃液氮中，行RT-PCR檢測。利用RT-PCR技術(shù)檢測α-SMA、collagen typeⅢ、TIMP-1，TGF-β的mRNA表達(dá)情況。實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)資料采用Spss13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)肺泡灌洗液(BALF)中PAI-1測定分

10、析結(jié)果:博萊霉素組7天、14天和28天PAI-1的活性持續(xù)升高，每周兩次向氣管內(nèi)注入PAI-1 SiRNA可使其活性降低。分別與同一時間點BLM組比較有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(均P＜0.05)。
　　(2) PCR結(jié)果:7、14天和28天BLM組α-SMA，collagen typeⅢ，TIMP-1的mRNA表達(dá)較Sham組的高;三個時間點PAI-1 SiRNA組α-SMA，TIMP-1，collagen typeⅢ的表達(dá)較BLM組低，有

11、顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);7天、28天時BLM組TGF-βmRNA表達(dá)較Sham組明顯升高，PAI-1 SiRNA組的TGF-β的mRNA表達(dá)較BLM組低，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，14天無明顯差別(P＞0.05）;B組和B+N組各時間點無明顯差別（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1博萊霉素大鼠氣管內(nèi)注入PAI-1SiRNA，能促進(jìn)ECM的降解，使膠原的合成減少，進(jìn)而阻礙肺纖維化的發(fā)展。
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