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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景及目的:
肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種重癥肺部疾病,是各種不同病因引起的間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease,ILD)病情進(jìn)展的最終結(jié)局。很多原因不明的ILD患者最后確診與結(jié)締組織病(connective tissue disease,CTD)相關(guān),稱(chēng)為結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病(connective tissue disease-associated inters
2、titiallung disease,CTD-ILD),其中以系統(tǒng)性硬化癥發(fā)病率最高,可高達(dá)60%至70%。而且結(jié)締組織病患者一旦出現(xiàn)了PF,預(yù)后極差,可在短期內(nèi)因重癥感染和/或呼吸衰竭死亡。目前糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑仍是主要方法,但是該方案副作用明顯,不良反應(yīng)多,且對(duì)中后期患者治效果差。因此研究其發(fā)病機(jī)制及治療方法尤為重要。
現(xiàn)在PF的確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,近些年來(lái),氧化應(yīng)激(oxidative stress)在PF發(fā)病
3、中的作用得到越來(lái)越多的重視。氧化應(yīng)激是一種引起分子、細(xì)胞和組織損傷的免疫應(yīng)答,其誘發(fā)是因?yàn)榛钚匝踝杂苫?reactive oxygen species,ROS)生成過(guò)多和/或抗氧化防御功能下降。研究發(fā)現(xiàn)吸入氣中氧分壓為150mmHg,肺泡中氧分壓為100mmHg,而靜脈血的氧分壓在1至45mmHg之間,這就表明肺一直暴露在高濃度的氧中,因此,相對(duì)于其他器官,肺更容易受到氧化應(yīng)激的損傷。而且聯(lián)合抗氧化應(yīng)激治療如應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸在PF治
4、療中取得一定的成果。
槲皮素(quercetin,QUE)在自然界中非常之多,其中在茶葉、槐花、洋蔥、西蘭花及柴胡等中含量較高,具有很多生物學(xué)活性。近年來(lái),越來(lái)越多的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)槲皮素進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其可以直接清除ROS,表現(xiàn)出明顯的抗氧化應(yīng)激作用。而且國(guó)外曾試用槲皮素治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病,取得了良好的效果。因此我們推測(cè)其有助于改善肺纖維化的進(jìn)展。
本研究旨在通過(guò)構(gòu)建博來(lái)霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的SD大鼠
5、肺纖維化模型,研究槲皮素對(duì)肺纖維化治療及其對(duì)氧化應(yīng)激的作用,同時(shí)還研究其對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)的MMP-1、TIMP-1、miR-21和TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響,以期發(fā)現(xiàn)其新的功能,指導(dǎo)其在臨床中的應(yīng)用。
方法:
將60只體重300g-350g的SD大鼠隨機(jī)平均分為3組:正常對(duì)照組、博來(lái)霉素組(BLM group)和博來(lái)霉素+槲皮素組(BLM+QUE group),每組20只。BLM組通過(guò)向氣管內(nèi)一次性注入BLM
6、5mg/kg構(gòu)建大鼠肺纖維化模型;正常對(duì)照組采取向氣管內(nèi)一次性注入同體積生理鹽水;BLM+QUE組采用向氣管內(nèi)一次性注入BLM5mg/kg的當(dāng)日給予腹腔內(nèi)注射槲皮素3mg/kg,每日一次,直至大鼠被處死。每組大鼠分別在建模后第12、24及36天隨機(jī)處死6只。
第一部分:槲皮素對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的治療作用
1.觀察大鼠的一般情況及肺組織的外觀,并稱(chēng)重,計(jì)算肺系數(shù)(lungcoefficient);同時(shí)觀察大鼠肺
7、組織的HE染色及Masson染色情況,并進(jìn)行纖維化評(píng)分。
2.顯微鏡下觀察大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的細(xì)胞,計(jì)算得出細(xì)胞總數(shù),并于染色后進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)。
3.檢測(cè)大鼠BALF中的總蛋白含量及肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量。
第二部分:槲皮素對(duì)肺纖維化大鼠氧化應(yīng)激的影響
檢測(cè)大鼠肺組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(m
8、alondialdehyde,MDA)的含量;檢測(cè)肺組織還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)及氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSH)的含量,并計(jì)算得出還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值;同時(shí)測(cè)定肺組織總抗氧化能力(total anti-oxidative capacity,T-AOC)。
第三部分:槲皮素對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞因子MMP-1及其抑制劑TI
9、MP-1的影響
1.提取肺組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和組織型金屬蛋白酶抑制劑-1(tissueinhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的mRNA的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
10、> 2.應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)肺組織中MMP-1和TIMP-1蛋白的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
第四部分:槲皮素對(duì)肺纖維化大鼠miR-21及TGF-β1/Smad信號(hào)通路的影響
1.將總RNA應(yīng)用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)miR-21的表達(dá)情況。
2.應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和Smad7
11、的mRNA的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
3.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)肺組織中TGF-β1和Smad7蛋白的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進(jìn)行,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn),多組之間比較采用單因素方差分析,以P<0.05被視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
第一部分:
1.大鼠一般情況:正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)皮毛光亮,活動(dòng)好,飲水進(jìn)食
12、量可,呼吸順暢,體重穩(wěn)步上升;BLM組大鼠皮毛無(wú)光澤,活動(dòng)減少,飲水進(jìn)食減少,呼吸急促,咳喘明顯,在第12天即表現(xiàn)出體重明顯下降,后期體重雖有所增加,但仍顯著少于正常對(duì)照組大鼠(12天、24天、36天:P<0.01),第7天死亡1只;BLM+QUE組大鼠皮毛光澤度一般,活動(dòng)有所減少,早期飲水進(jìn)食略減少,有咳喘,后有所緩解,其體重明顯高于同時(shí)間BLM組(12天、24天、36天:P<0.01)。
2.肺組織情況:正常對(duì)照組不同時(shí)間
13、點(diǎn)外表紅潤(rùn)光滑,質(zhì)地均勻,富有彈性;BLM組早期腫脹明顯,點(diǎn)灶狀出血較明顯,晚期實(shí)變明顯,體積明顯縮小;BLM+QUE組顏色略偏深,表面少許點(diǎn)狀出血,彈性一般。不同時(shí)間點(diǎn)BLM組大鼠肺系數(shù)較正常對(duì)照組明顯增高(12天、24天、36天:P<0.05);不同時(shí)間點(diǎn)BLM+QUE組大鼠肺系數(shù)小于BLM組,二者在第36天時(shí)有明顯差異(P<0.05)。
3.病理學(xué)情況:HE染色及Masson染色結(jié)果表明,正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)明顯炎
14、癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和膠原纖維的沉積;BLM組大鼠早期即發(fā)現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),少量膠原纖維沉積;后期可見(jiàn)炎癥細(xì)胞明顯減少,肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯,肺間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維沉積;BLM+QUE組大鼠的早期炎癥較輕,炎癥細(xì)胞較少;后期纖維化程度較輕。不同時(shí)間點(diǎn)BLM組大鼠纖維化分?jǐn)?shù)較正常對(duì)照組明顯升高(12天、24天、36天:P<0.01);而不同時(shí)間點(diǎn)BLM+QUE組大鼠纖維化分?jǐn)?shù)明顯小于BLM組(12天:P<0.05,24天、36天:P<0.01)。
15、r> 4.BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)計(jì)數(shù)無(wú)明顯變化;不同時(shí)間點(diǎn)BLM組細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于正常對(duì)照組(12天、24天、36天:P<0.01);不同時(shí)間點(diǎn)BLM+QUE組細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于BLM組(12天、24天、36天:P<0.05)。分類(lèi)計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞比例無(wú)顯著變化;BLM組大鼠與正常對(duì)照組相比中性粒細(xì)胞比列有增高趨勢(shì),在36天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05
16、),淋巴細(xì)胞比例有增高趨勢(shì),12天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12天、24天、36:P<0.05),巨噬細(xì)胞比例有下降趨勢(shì),12天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12天、24天、36天:P<0.05);BLM+QUE組大鼠與BLM組相比,中性粒細(xì)胞比例有所下降,在36天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)、淋巴細(xì)胞比例有所下降,24天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24天、36天:P<0.05),巨噬細(xì)胞比例有所升高,36天后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
17、 5.BALF總蛋白及大鼠肺組織HYP含量測(cè)定:正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)BALF總蛋白含量無(wú)明顯變化;BLM組BALF總蛋白第12天明顯升高,此后逐步下降,但仍明顯高于正常對(duì)照組(12天、24天:P<0.01;36天:P<0.05); BLM+QUE組BALF總蛋白含量24天后明顯低于BLM組(24天、36天P<0.01)。正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織HYP含量無(wú)明顯變化;BLM組肺組織HYP含量較正常對(duì)照組明顯增加(12天:P<0.05,2
18、4天、36天:P<0.01); BLM+QUE組肺組織HYP含量24天后較BLM組明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24天、36天:P<0.01)。
第二部分:
1.大鼠肺組織MDA含量測(cè)定:正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織MDA含量無(wú)明顯變化;第12天時(shí)三組大鼠肺組織MDA含量差異無(wú)顯著差異;BLM組大鼠24天后MDA含量明顯高于正常對(duì)照組(24天、36天:P<0.01);36天后BLM+QUE組大鼠MDA含量明顯低于BLM組
19、(P<0.01)。
2.大鼠肺組織GSH/GSSH比值:正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織GSH/GSSH無(wú)明顯變化;BLM組24天后肺組織GSH/GSSH較正常對(duì)照組明顯降低(24天、36天:P<0.01); BLM+QUE組24天后肺組織GSH/GSSH明顯高于BLM組(24天、36天:P<0.01)。
3.大鼠肺組織T-AOC測(cè)定:正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織T-AOC無(wú)明顯變化;BLM組肺組織24天后T-AOC顯著低于
20、正常對(duì)照組(24天:P<0.05,36天:P<0.01); BLM+QUE組24天后肺組織T-AOC較BLM組大鼠明顯增加(24天、36天:P<0.05)。
第三部分:
1.RT-PCR檢測(cè)MMP-1和TIMP-1的mRNA表達(dá):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-1和TIMP-1的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化;與正常對(duì)照組相比, BLM組MMP-1和TIMP-1的mRNA均顯著增加(12天、24天、36天MMP-1:P<0.01
21、;12天TIMP-1:P<0.05,24天、36天TIMP-1:P<0.01);與BLM組相比,BLM+QUE組MMP-1和TIMP-1的mRNA水平明顯下降,均在24天后表現(xiàn)為顯著性差異(24天、36天MMP-1: P<0.05;24天TIMP-1:P<0.05,36天TIMP-1:P<0.01)。
2.免疫組化測(cè)定MMP-1和TIMP-1蛋白表達(dá):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-1及TIMP-1蛋白表達(dá)變化不明顯;與正常對(duì)照組
22、相比,BLM組MMP-1及TIMP-1蛋白表達(dá)明顯增加(12天、24天、36天MMP-1: P<0.01;12天、24天TIMP-1:P<0.05,36天TIMP-1:P<0.01);不同時(shí)間點(diǎn)BLM+QUE組大鼠MMP-1及TIMP-1蛋白表達(dá)均低于BLM組,MMP-1在24天后表現(xiàn)為顯著性差異(24天:P<0.01,36天:P<0.05),TIMP-1在36天后表現(xiàn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
第四部分:
1.
23、RT-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)miR-21表達(dá)無(wú)明顯變化;與正常對(duì)照組相比,BLM組miR-21水平顯著增加(12天:P<0.05、24天、36天:P<0.01);與BLM組相比,BLM+QUE組miR-21水平比明顯下降,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24天:P<0.05,36天:P<0.01)。
2.RT-PCR檢測(cè)TGF-β1和Smad7的mRNA表達(dá):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和Smad7的m
24、RNA表達(dá)無(wú)明顯變化;與正常對(duì)照組相比,BLM組TGF-β1mRNA顯著增加(12天、24天、36天:P<0.01),Smad7 mRNA顯著減少(12天:P<0.05,24天、36天:P<0.01);與BLM組相比,BLM+QUE組TGF-β1 mRNA水平比明顯下降(12天、24天、36天:P<0.01),Smad7 mRNA水平明顯升高,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(24天、36天:P<0.05)。
3.Western bl
25、ot法檢測(cè)TGF-β1和Smad7蛋白的表達(dá):正常對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1和Smad7蛋白表達(dá)變化不明顯;與正常對(duì)照組相比,BLM組TGF-β1顯著增加(12天、24天、36天:P<0.01),Smad7顯著減少,24天后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24天、36天:P<0.05);與BLM組相比,BLM+QUE組TGF-β1水平比明顯下降(12天、24天、36天:P<0.01),Smad7水平明顯升高,24天后表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(24天、36天:P
26、<0.05)。
結(jié)論:
1.通過(guò)經(jīng)氣管注入博來(lái)霉素的方法可以成功構(gòu)建大鼠肺纖維化模型,用于肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究。
2.槲皮素能夠改善肺纖維化大鼠的總體狀況,減輕其炎性損傷和減少膠原蛋白沉積。
3.槲皮素不但可以抑制肺組織ROS生成,而且還增強(qiáng)肺組織的抗氧化能力,表明其能夠抑制氧化應(yīng)激減輕肺纖維化。
4.槲皮素能夠抑制MMP-1、TIMP-1的表達(dá),部分恢復(fù)MMPs/TIMPs失衡狀態(tài),減少
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