microRNAs調(diào)控口腔鱗癌增殖及凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：從全球范圍看，相對(duì)于全身其他部位的惡性腫瘤來說，頭頸部鱗癌惡性腫瘤的發(fā)生率較高，位列第6，每年有大約50萬的新發(fā)病例，并且造成20萬人的死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，頭頸部惡性腫瘤的發(fā)病率為20.6/10萬，其中以口腔癌發(fā)病率最高，最常見病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，占比約90％。microRNAs（miRNAs）是19-23個(gè)堿基大小的RNA序列，廣泛存在于動(dòng)植物、甚至細(xì)菌中，雖然不編碼蛋白質(zhì)，卻能對(duì)細(xì)胞的生理及病理過程能起到重要的作用。腫瘤的發(fā)

2、生是基因突變的結(jié)果，其的形成及發(fā)展過程中伴隨著多種miRNAs的異常表達(dá)，這種異常表達(dá)隨著腫瘤部位及組織及病理特征的不同而變化。為了更深入的認(rèn)識(shí)miRNAs在口腔鱗狀細(xì)胞癌中所發(fā)揮的作用，本研究對(duì)影響調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的miRNAs進(jìn)行了篩選、鑒定并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具體作用機(jī)制。
　　方法：我們對(duì)選取的8對(duì)口腔鱗癌及其癌旁正常組織進(jìn)行miRNA芯片分析篩選口腔鱗癌組織中差異化表達(dá)的 miRNAs；在臨床樣本及口腔鱗癌細(xì)胞系

3、中利用real-timePCR的方法進(jìn)行差異性驗(yàn)證，通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)篩選出的差異化miRNAs進(jìn)行基因功能的檢測(cè)；我們進(jìn)行了體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8實(shí)驗(yàn)）、單細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞周期檢測(cè)，以評(píng)估篩選出的miRNAs對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及凋亡的影響。通過生物信息學(xué)網(wǎng)站的分析預(yù)測(cè)以及雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)尋找并驗(yàn)證其相關(guān)靶基因；應(yīng)用轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)檢測(cè)及免疫印跡法(Western blot)驗(yàn)證miRNAs對(duì)相應(yīng)靶基因在

4、mRNA及蛋白質(zhì)水平的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：miR-330-3p在29對(duì)口腔鱗癌患者臨床組織樣本（每對(duì)樣本包括口腔鱗癌組織以及其癌旁正常組織）中的表達(dá)為：癌旁組織中miR-330-3p的表達(dá)量（10-3×U6）為7.476±3.537，口腔鱗癌組織表達(dá)量為13.059±5.045（t=5.282，n=29， P<0.0001），兩組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-330-3p在增殖能力較弱的HN4及HN6細(xì)胞系中表達(dá)水平較低，而在高增

5、殖能力的 HN13及 SCC25中表達(dá)水平較高；miR-330-3p過表達(dá)能明顯提高癌細(xì)胞的增殖及單細(xì)胞克隆形成能力，并且顯著降低口腔鱗癌細(xì)胞的凋亡率；深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p能夠在mRNA及蛋白質(zhì)水平上負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因程序性細(xì)胞凋亡因子4（PDCD4）的表達(dá)，降低鱗癌細(xì)胞的凋亡率，從而間接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)論：miR-330-3p在口腔鱗癌細(xì)胞中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，并且與患者預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)；miR-