食管鱗癌中l(wèi)ncRNA TP73-AS1表達及對增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景和目的：
　　食管癌(esophageal carcinoma，EC)是一種高度惡性的消化道腫瘤，有2種重要類型：食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）和食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC），食管腺癌在西方國家比較多見，食管鱗狀細胞癌在發(fā)展中國家更流行。河南林州是食管癌的高發(fā)區(qū)，占當(dāng)?shù)厝繍盒阅[瘤的81.4％。目前，外科手術(shù)治療是治療早期食管

2、癌的首選方法，但很多中晚期患者確診時已失去手術(shù)治療的機會。因此，食管癌患者總的五年存活率很低。盡管多個遺傳和表觀遺傳變化已在食管鱗癌被發(fā)現(xiàn)，但食管癌的確切發(fā)病機制仍有待進一步研究。因此進一步從分子水平研究食管癌的發(fā)生發(fā)展，有重要的現(xiàn)實意義和理論價值。
　　長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一種長度大于200個核苷酸的非編碼 RNA。在人體內(nèi)，lncRNA在基因內(nèi)的分布非常廣泛，雖然 lncR

3、NA并不編碼蛋白質(zhì)，但是其參與構(gòu)成復(fù)雜且非常重要的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而巧妙地調(diào)節(jié)基因表達。近來研究結(jié)果顯示 lncRNAs在正常組織發(fā)育以及調(diào)控細胞多能性和細胞分化的過程中起重要作用。此外，lncRNAs參與控制多種分子途徑，引起基因表達改變，最終調(diào)控細胞增殖、凋亡與細胞遷移。因此 lncRNAs的表達失調(diào)與人類多種疾病密切相關(guān)，比如腫瘤形成。
　　lncRNA TP73-AS1定位于1p36.32，查閱國內(nèi)外文獻目前關(guān)于 ln

4、cRNATP73-AS1的報道非常少，僅 Yu等的研究顯示對比正常肺組織，lncRNATP73-AS1在非小細胞型肺癌中表達顯著下降；對比腺癌，小細胞肺癌和鱗癌，lncRNATP73-AS1在大細胞肺癌中表達顯著升高，這項結(jié)果提示lncRNATP73-AS1在腫瘤的發(fā)展進程中可能扮演了重要角色。目前未發(fā)現(xiàn)lncRNA TP73-AS1在食管癌中的相關(guān)報道。我們的研究第一次綜合分析了lncRNATP73-AS1在食管癌中表達和生物學(xué)作用，

5、并初步探討了其腫瘤調(diào)節(jié)作用的分子機制。
　　本研究包括三部分：第一部分：食管鱗狀細胞癌組織中 lncRNA異常表達及與臨床病理特征相關(guān)性分析；第二部分：調(diào)控lncRNATP73-AS1表達對食管鱗癌細胞系 EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影響；第三部分：lncRNATP73-AS1作用機制的初步研究。
　　第一部分食管鱗狀細胞癌組織中l(wèi)ncRNA異常表達及與臨床病理特征相關(guān)性分析
　　方法：
　　1.收集了

6、60例食管鱗狀上皮細胞癌組織標(biāo)本，包括60例食管鱗狀上皮細胞癌組織和60例配對的癌旁正常組織標(biāo)本。
　　2.運用lncRNA基因芯片檢測食管鱗狀上皮細胞癌組織和配對的癌旁組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA的表達情況。
　　3.運用qRT-PCR檢測60例標(biāo)本中4種lncRNA(lncRNA TP73-AS1、lncRNA LOC345051、lncRNA XLOC_008700和lncRNA TMEM71)表達水平，驗證lncRNA芯片

7、結(jié)果的可靠性。
　　4.依據(jù)lncRNA TP73-AS1的表達水平，運用雙變量相關(guān)性分析其與食管癌病人年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1. lncRNA芯片檢測分析得到89個差異表達的lncRNA，其中在食管鱗癌組織中上調(diào)的lncRNA有29個（32.6%），下調(diào)的lncRNA有60個（67.4%）。lncRNA TP73-AS1在食管鱗狀上皮細胞癌組織中表達增高。

8、r>　　2.qRT-PCR結(jié)果顯示在4種lncRNA中，只有l(wèi)ncRNA TMEM71驗證結(jié)果和基因芯片結(jié)果不一致，其余3種lncRNA用lncRNA檢測芯片和qRT-PCR兩種方法得到的結(jié)果具有很好的一致性，證實了芯片數(shù)據(jù)的可靠性。
　　3.雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示lncRNA TP73-AS1的表達水平與食管癌定位及TNM分期相關(guān)(P>0.05)，與病人的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度無相關(guān)性(P<0.05)。
　

9、　第二部分調(diào)控lncRNA TP73-AS1表達對食管鱗癌細胞系EC9706和KYSE30增殖和凋亡的影響
　　方法：
　　1.制備沉默lncRNA TP73-AS1表達的重組慢病毒，感染對數(shù)生長期EC9706和KYSE30細胞,得到下調(diào)lncRNA TP73-AS1表達的EC9706和KYSE30細胞株。
　　2.CCK-8試劑和克隆形成實驗檢測下調(diào)lncRNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細胞增殖能

10、力的影響。
　　3.Transwell實驗用來檢測下調(diào)lncRNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.流式細胞術(shù)和Hoechst33342染色檢測下調(diào)lncRNA TP73-AS1對EC9706和KYSE30細胞凋亡的影響。
　　5.裸鼠移植瘤實驗從體內(nèi)水平檢測調(diào)控lncRNA TP73-AS1表達對食管癌的影響。
　　結(jié)果：
　　1.對比空白對照組，轉(zhuǎn)染lncR

11、NATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組的lncRNA TP73-AS1表達水平顯著下調(diào)（P<0.01）,得到下調(diào)lncRNA TP73-AS1表達的EC9706和KYSE30細胞株。
　　2.CCK8實驗結(jié)果顯示：與對照組比較，lncRNATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組EC9706和KYSE30細胞的生長在轉(zhuǎn)染24h后出現(xiàn)顯著抑制（P<0.

12、05），并且隨時間的延長而日益顯著。
　　3. EC9706細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示空白對照組，無關(guān)序列對照組，lncRNA TP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組克隆形成數(shù)分別為162.0±19.3；167.4±18.3；47.3±7.8和56.3±7.8。KYSE30細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示空白對照組，無關(guān)序列對照組，lncRNATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-A

13、S1 siRNA2組克隆形成數(shù)分別為155.0±17.2;159.2±18.6;43.5±7.5和49.5±7.5。說明下調(diào)食管癌細胞中l(wèi)ncRNA TP73-AS1表達，EC9706和KYSE30細胞克隆數(shù)顯著減少（P<0.05），其生長受到顯著抑制。
　　4.AnnexinV/Pl染色結(jié)果提示：lncRNATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組EC9706和KYSE30細胞凋亡率與siR

14、NA無關(guān)序列和空白對照組對照組相比顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.EC9706細胞Hoechst33342染色實驗結(jié)果顯示空白對照組、siRNA無關(guān)序列對照組細胞的凋亡率分別為(5.21±0.61)%和(5.42±0.72)%；lncRNA TP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組細胞凋亡率為(20.72±3.28)%和(18.70±3.10)%，與空白對照組、siRN

15、A無關(guān)序列對照組細胞的凋亡數(shù)比較顯著升高，差異均有顯著性(P<0.05)。KYSE30細胞實驗結(jié)果顯示空白對照組、siRNA無關(guān)序列對照組細胞的凋亡率分別為(6.12±0.75)%和(5.80±0.65)%；lncRNATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組細胞凋亡率為(23.36±4.23)%和(24.20±4.30)%，相比空白對照組和siRNA無關(guān)序列對照組，細胞的凋亡數(shù)顯著升高，差異有顯著

16、性(P<0.05)。
　　6.Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示lncRNATP73-AS1 siRNA1組和lncRNATP73-AS1 siRNA2組細胞侵襲數(shù)與空白對照組和siRNA無關(guān)序列對照組相比差異無顯著性(P>0.05)。
　　7.裸鼠移植瘤體內(nèi)實驗結(jié)果顯示對比空白對照組和siRNA無關(guān)序列對照組，lncRNATP73-AS1 siRNA組移植瘤顯著減小，熒光信號值也顯著降低(P<0.05)。
　　第三部

17、分lncRNA TP73-AS1作用機制的初步研究
　　方法：
　　1.采用mRNA芯片檢測下調(diào)lncRNA TP73-AS1表達和無關(guān)序列對照siRNA的EC9706和KYSE30細胞的mRNA表達譜。
　　2.分析芯片結(jié)果，使用qRT–PCR和Western-blot檢測下調(diào)lncRNA TP73-AS1表達EC9706和KYSE30細胞中的BDH2的表達水平。
　　3.制備沉默 BDH2表達的EC9706和

18、KYSE30細胞。CCK-8試劑盒、Hoechst33342染色和Western Blot檢測下調(diào)BDH2對食管癌細胞增殖和凋亡的影響。
　　4.qRT-PCR檢測60例食管癌標(biāo)本和對應(yīng)癌旁組織中BDH2 mRNA表達情況并與臨床病理特征和lncRNA TP73-AS1進行相關(guān)性分析。
　　5.構(gòu)建 lncRNA TP73-AS1野生型和突變型載體，qRT–PCR檢測野生型和突變型lncRNA TP73-AS1對 EC970

19、6和KYSE30細胞株中miR-141-3p表達的影響。
　　6.雙熒光素酶報告實驗驗證BDH2是miR-141-3p的靶基因。
　　7.克隆形成實驗和流式細胞儀檢測上調(diào) miR-141-3p表達對食管癌細胞生長和凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1. mRNA芯片分析結(jié)果顯示：對比轉(zhuǎn)染無關(guān)序列 siRNA對照組的EC9706和KYSE30細胞，轉(zhuǎn)染lncRNA TP73-AS1 siRNA食管癌細胞中BDH2的含量

20、顯著降低。
　　2. qRT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示對比空白對照和無關(guān)序列對照組，下調(diào)食管鱗癌細胞EC9706和KYSE30中l(wèi)ncRNA TP73-AS1的表達顯著抑制了BDH2 mRNA和蛋白的表達(P<0.05)。
　　3.對比空白對照和無關(guān)序列對照組，EC9706和KYSE30細胞轉(zhuǎn)染入 BDH2 siRNA1和BDH2 siRNA2后，BDH2表達均顯著下降(P<0.05)。
　　4.CCK

21、8結(jié)果顯示，與對照組比較，BDH2 siRNA1組和BDH2 siRNA2組EC9706和KYSE30細胞在轉(zhuǎn)染后24h后出現(xiàn)顯著生長抑制（P<0.05），并且隨時間的延長而日益顯著。
　　5.EC9706細胞Hoechst33342染色實驗結(jié)果顯示空白對照組、siRNA無關(guān)序列對照組細胞的凋亡率分別為(4.22±0.45)%和(4.31±0.47)%；BDH2 siRNA1組和BDH2 siRNA2組細胞凋亡率為(17.70±1

22、.80)%和(16.11±1.75)%，與siRNA無關(guān)序列對照組、空白對照組細胞的凋亡數(shù)相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。KYSE30細胞實驗結(jié)果顯示空白對照組、siRNA無關(guān)序列對照組細胞的凋亡率分別為(5.23±0.45)%和(5.40±0.52)%；BDH2 siRNA1組和BDH2 siRNA2組細胞凋亡率為(19.71±2.10)%和(17.20±1.80)%，相比空白對照組和siRNA無關(guān)序列對照組，細胞的

23、凋亡數(shù)顯著升高，差異具有顯著性(P<0.05)。
　　6.對比空白對照組，轉(zhuǎn)染BDH2 siRNA1或lncRNATP73-AS1 siRNA1后，EC9706和KYSE30細胞中BDH2表達顯著下降；cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表達顯著升高；但是Bcl-2，Bax和pro-caspase-9的表達在三個實驗組之間無顯著差異。
　　7.對比癌旁正常組織，食管癌組織中BDH2表達顯著升

24、高(P<0.05)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示食管癌組織中 BDH2的表達水平與食管癌 TNM分期密切相關(guān)，與病人的年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和腫瘤部位無相關(guān)性(P<0.05)。食管癌組織中l(wèi)ncRNA TP73-AS1表達與BDH2 mRNA表達存在顯著正相關(guān)性（R2=0.619）
　　8.生物信息學(xué)分析lncRNA TP73-AS1和miR-141-3p存在2個相互作用的seed region區(qū)特異結(jié)合位點,分別位于 chr1

25、:3655109-3655129[-]和chr1:3662504-3662525[-]。
　　9.lncRNATP73-AS1通過與2個seed region區(qū)特異結(jié)合對EC9706和KYSE30細胞株中miR-141-3p表達起負(fù)調(diào)控作用。
　　10.BDH2是miR-141-3p的靶基因。轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimics能抑制食管癌細胞生長，誘導(dǎo)其細胞凋亡，提示 lncRNA TP73-AS1通過作用于 miR-1

26、41-3p增加BDH2表達，從而抑制食管癌細胞生長，促進其凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.本研究篩選得到89個差異表達的lncRNA基因，其中有29個（32.6%）上調(diào)，60個（67.4%）下調(diào)。lncRNA TP73-AS1和BDH2在食管鱗癌組織中異常高表達，二者表達存在正相關(guān)，且與TNM分期相關(guān)。
　　2.下調(diào)食管鱗癌EC9706和KYSE30細胞中l(wèi)ncRNA TP73-AS1表達可有效抑制食管鱗癌EC9706和K

27、YSE30細胞的增殖并且促進細胞凋亡。
　　3.lncRNATP73-AS1通過與2個seed region區(qū)特異結(jié)合負(fù)調(diào)控miR-141-3p表達；BDH2是miR-141-3p的靶基因，miR-141-3p通過與BDH23’UTR結(jié)合負(fù)調(diào)控其表達。食管鱗癌中l(wèi)ncRNA TP73-AS1對增殖和凋亡作用的機制可能部分是由于lncRNA TP73-AS1通過調(diào)控miR-141-3p表達，進而影響B(tài)DH2基因表達，發(fā)揮其生物學(xué)作用