高膽固醇膳食誘導BSEP在肝細胞膽小管側(cè)膜表達減退的分子機制.pdf

1、目的：
　　膽囊結(jié)石是我國較為常見的疾病之一，隨著人民生活水平的提高，其發(fā)病率有不斷上升的趨勢，嚴重危害著人民的健康和生活質(zhì)量。膽囊結(jié)石的成因一直是膽道外科學研究的熱點，經(jīng)過多年探索，這一研究領(lǐng)域已從最初的膽石、膽汁理化性質(zhì)分析，深入到了分子生物學、基因?qū)W等。目前研究發(fā)現(xiàn)膽囊結(jié)石主要發(fā)病機制包括脂質(zhì)代謝異常、膽囊功能異常及基因易感性。在致石易感基因研究中，Lith-1和Lith-2的重要性較為肯定，肝細胞膽小管側(cè)膜的膽汁酸鹽輸出泵

2、(Bile salt exportpump，BSEP, ABCB11)為Lith-1最有可能的易感基因[1,2]，主要負責肝細胞膽汁酸分泌，是膽汁酸分泌的限速步驟，同時膽汁酸鹽通過膽小管轉(zhuǎn)運是肝臟分泌膽汁的重要驅(qū)動力。
　　BSEP基因表達主要受法尼醇X受體(Farnesoid X receptor, FXR)調(diào)控，在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum，RER)中完成蛋白合成、折疊及初級糖基化，經(jīng)高

3、爾基體(Golgi apparatus)進一步加工修飾，分選及分泌，途經(jīng)頂端循環(huán)內(nèi)體(apical recycling endosomes，ARE)到達膽汁腔面參與膽汁酸分泌，并且根據(jù)機體需要在膽小管側(cè)膜與循環(huán)內(nèi)體之間進行交換。BSEP胞外分泌(exocytosis)需要有肌球蛋白輕鏈(MLC)，Rab11a及肌球蛋白Vb(myosin Vb)等的參與，其內(nèi)吞需要網(wǎng)格蛋白系統(tǒng)的識別機制，包括Hax-1，cortactin，EPS15以及

4、肌動蛋白結(jié)合蛋白等的相互作用[3]。
　　既往研究肝細胞膽小管側(cè)膜BSEP的表達及轉(zhuǎn)運功能在小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成中的作用時發(fā)現(xiàn)，高膽固醇膳食飼養(yǎng)后，C57L小鼠BSEP基因表達上調(diào)5倍，但膽汁酸鹽分泌卻不增加，說明高膽固醇膳食雖然能誘導BSEP基因水平表達增高，但確使最終在肝細胞膽小管側(cè)膜發(fā)揮作用的BSEP轉(zhuǎn)運功能明顯下降，導致肝細胞膽汁酸鹽分泌顯著減少，促進膽固醇結(jié)石形成[4]。
　　目前關(guān)于高膽固醇膳食時BSEP在肝細

5、胞膽小管側(cè)膜表達調(diào)控機制研究較少，本實驗通過飲食法建立C57L小鼠膽囊膽固醇結(jié)石模型，并觀察BSEP、PKCα及磷酸化PKCα在肝細胞膽小管側(cè)膜的表達情況，以及BSEP與HAX-1共表達情況，探討高膽固醇膳食誘導BSEP在肝細胞膽小管側(cè)膜表達減退的分子機制。
　　方法：
　　本實驗使用C57L小鼠進行隨機分組，建立高膽固醇膳食組及普通膳食對照組模型，喂養(yǎng)8周后，收集、觀察兩組血及膽汁中膽固醇、膽汁酸等含量，判斷膽囊內(nèi)結(jié)石性質(zhì)

6、;并且通過Western blot檢測BSEP、PKCα及p-PKC在膽小管側(cè)膜的表達情況，通過免疫熒光單染色觀察BSEP表達情況;通過免疫共沉淀和免疫熒光雙染實驗方法，觀察肝細胞膽小管側(cè)膜BSEP與HAX-1的共表達情況。
　　結(jié)果：
　　1、致石率判定:24只實驗小鼠全部存活;致石組12只小鼠全部成石(12/12，成石率:100％)。收集結(jié)石經(jīng)紅外光譜檢測，表明結(jié)石成分以膽固醇為主，各標本成分均一致，證明小鼠膽囊膽固醇結(jié)

7、石模型建立成功;
　　2、小鼠血清生化學檢測:致石組小鼠血清膽固醇含量較對照組明顯增高(t=7.36，P＜0.01);血清甘油三脂含量較對照組無明顯變化(t=1.808，P＞0.05);血清總膽汁酸含量較對照組增高(t=7.26，P＜0.01);血清HDL含量較對照組增高(t=3.806，P＜0.05);血清LDL含量較對照組增高(t=5.852，P＜0.05);
　　3、小鼠膽汁生化學檢測:致石組膽汁中的膽固醇(6.87u

8、mol/L)明顯高于對照組(2.43umol/L)，而膽汁總膽汁酸的含量明顯(48288.0umol/L)低于對照組(614112umol/L);
　　4、肝細胞膽小管側(cè)膜BSEP表達:Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)致石組小鼠肝細胞膽小管側(cè)膜BSEP表達較對照組(t=14.302，P＜0.01)顯著降低;免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)致石組BSEP在膽小管側(cè)膜表達較對照組減弱;
　　5、肝細胞膽小管側(cè)膜PKCα及磷酸化-PKCα表達:W

9、estern Blot檢測發(fā)現(xiàn)PKCα致石組與對照組無明顯區(qū)別(t=0.525，P＞0.05)，磷酸化-PKCα致石組與對照組相比顯著增加(t=6.136，P＜0.01);
　　免疫共沉淀測定及免疫熒光雙染表明BSEP與HAX-1共同表達于肝細胞膽小管側(cè)膜，并相互作用。
　　結(jié)論：
　　1、高膽固醇膳食誘導C57L小鼠膽囊膽固醇結(jié)石的形成過程中，血清膽固醇、HDL、血清膽汁酸明顯升高，膽汁中膽固醇含量升高，總膽汁酸減少

10、，膽汁中膽固醇過飽和是C57L小鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成的重要原因;
　　2、高膽固醇膳食誘導C57L小鼠膽囊膽固醇結(jié)石的形成過程中BSEP在膽小管側(cè)膜表達顯著下降，導致膽汁中總膽汁酸含量減少;
　　3、高膽固醇膳食誘導C57L小鼠膽囊膽固醇結(jié)石的形成過程中磷酸化PKCα顯著升高，可能誘導BSEP連接區(qū)域的絲氨酸磷酸化;
　　4、BSEP與HAX-1在肝細胞膽小管側(cè)膜共表達，高膽固醇膳食致石后二者共表達增加，可能是BSEP