RNA結(jié)合蛋白QKI在造血系統(tǒng)髓系分化中的表達調(diào)控及其功能研究.pdf

1、髓系是造血系統(tǒng)分化發(fā)育過程中一支重要的譜系，其進一步分化成熟產(chǎn)生單核/巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，這兩類細(xì)胞是機體固有免疫的主要組成者，是機體實施免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)的重要分子，因此研究這兩類細(xì)胞的分化有著重要的生理意義。而目前認(rèn)為，在細(xì)胞因子的作用下，細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達或關(guān)閉在細(xì)胞分化過程中起著主導(dǎo)的地位,其調(diào)控異常是造血系統(tǒng)腫瘤發(fā)生啟動因素和治療靶點。因此發(fā)現(xiàn)和深入研究這些基因表達調(diào)控的機制有助于認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)展機制,為腫瘤的防治提

2、供重要依據(jù).
　　QKI是一類RNA結(jié)合蛋白，由于其上游調(diào)控區(qū)的部分缺失引起組織特異性的QKI表達降低導(dǎo)致神經(jīng)髓鞘發(fā)育障礙，小鼠出生后10天出現(xiàn)嚴(yán)重的震顫表型，故命名為QKI（quaking）。它屬于RNA結(jié)合蛋白STAR（signalsTransductionsActivatorsofRNAs）家族，此蛋白結(jié)構(gòu)具有結(jié)合上游蛋白激酶的SH3結(jié)構(gòu)域，同時又具有RNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特征，具有介導(dǎo)上游蛋白激酶和調(diào)控下游基因表達的雙重角色

3、，是重要的功能分子。目前對于它的研究大部分集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。QKI主要通過調(diào)控髓鞘形成過程中重要分子，如MBP、MAG等的表達來參與髓鞘的形成。作為RNA結(jié)合蛋白，QKI對靶分子的調(diào)控主要是通過識別并結(jié)合于mRNA3’UTR上的特定序列即QKI反應(yīng)元件（QRE）來調(diào)控其表達。這一調(diào)控發(fā)生在mRNA細(xì)胞內(nèi)的定位、mRNA的穩(wěn)定性以及翻譯效率的改變等多個環(huán)節(jié)。
　　除了在神經(jīng)系統(tǒng)外，QKI還在多種組織和器官中廣泛表達，參與多個系統(tǒng)

4、的發(fā)育和細(xì)胞增殖、分化與凋亡。一些ENU誘導(dǎo)的QKI純合突變的小鼠出現(xiàn)胚胎致死表型，目前認(rèn)為與卵黃囊時期的胚胎造血異常密切相關(guān)。在2005年發(fā)表于NatStructMolBio上的一篇文章中預(yù)測的眾多QKI靶分子中，有部分與造血系統(tǒng)髓系分化密切相關(guān)。因此我們將QKI的研究集中在造血系統(tǒng)髓系的分化與發(fā)育上。
　　首先，我們在白血病細(xì)胞HL-60和THP-1的誘導(dǎo)分化模型中發(fā)現(xiàn)，造血系統(tǒng)髓系向單核/巨噬系和粒系分化過程中，QKImRN

5、A和蛋白表達水平均明顯降低，可能與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。利用生物信息學(xué)分析QKI上游啟動子區(qū)約2000bp，發(fā)現(xiàn)多個調(diào)控髓系分化的重要轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點；其中轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα的表達水平變化與QKI一致，且QKI的變化發(fā)生在C/EBPα變化之后，提示QKI可能是C/EBPα的下游分子；進一步利用QKI啟動子的熒光素酶報告系統(tǒng)檢測和體內(nèi)的ChIP實驗進一步證實C/EBPα直接結(jié)合于QKI啟動子距起始碼ATG上游約1872bp-2036bp處上調(diào)

6、其表達；隨著分化的進程，由于C/EBPα的減少，結(jié)合于QKI啟動子的C/EBPα減少，導(dǎo)致表達水平的下降。
　　單核/巨噬細(xì)胞分化過程中蛋白表達分析發(fā)現(xiàn)，決定單核/巨噬細(xì)胞譜系定向分化的特異性分子單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體CSF1R（Macrophage-colonystimulatingfactorreceptor，M-CSFR,又稱為CSF1R）與QKI的表達趨勢相反；在細(xì)胞內(nèi)干涉或過表達QKI后，CSF1R也出現(xiàn)相反的表達

7、變化，CSF1R是QKI的一個下游分子并受其負(fù)調(diào)控；在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找并比對不同種屬間CSF1R3’UTR的序列，發(fā)現(xiàn)在人、牛、小鼠和貓之間同源性很高且均含有一個或兩個QKI反應(yīng)元件；將CSF1R3’UTR構(gòu)建報告基因同時結(jié)合體內(nèi)的RNA-IP實驗證實QKI直接作用于CSF1R3’UTR降低其mRNA的穩(wěn)定性而負(fù)調(diào)控CSF1R的表達。由此證實，在單核/巨噬細(xì)胞分化過程中，QKI表達水平的降低解除了對CSF1RmRNA的降解，使其表達

8、水平升高，接受配體M-CSF信號的刺激，促使前體細(xì)胞一步步向單核/巨噬細(xì)胞分化。
　　粒細(xì)胞分化模型中發(fā)現(xiàn)，在10％血清條件下，ATRA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞不完全分化，以細(xì)胞周期阻滯為主要效應(yīng)時，QKI表達無明顯變化；在2％血清條件下，ATRA誘導(dǎo)絕大部分細(xì)胞分化為成熟的粒細(xì)胞，QKI在mRNA和蛋白水平均明顯降低；改用另一較強的誘導(dǎo)分化劑DMSO，使大部分細(xì)胞快速分化為成熟的粒細(xì)胞時，QKI在mRNA和蛋白水平出現(xiàn)明顯迅速的降低。

9、由此看出，QKI的降低速度和程度與細(xì)胞分化的速度與程度呈正比；在這一過程中，QKI與C/EBPα的變化一致，因此QKI的降低與C/EBPα調(diào)控的減弱有關(guān)。另外，在粒系分化過程中，轉(zhuǎn)入siRNA加速內(nèi)源QKI的降低，細(xì)胞核形態(tài)檢測發(fā)現(xiàn)前體細(xì)胞立即分化為成熟的粒細(xì)胞。由此初步得出結(jié)論，QKI在粒細(xì)胞的終末分化和活化中發(fā)揮重要調(diào)控作用。深入的機理研究正在進行當(dāng)中。
　　此外，為了在血液細(xì)胞中實現(xiàn)QKI過表達來進行深入的功能研究，我們還構(gòu)

10、建和包裝了過表達QKI的慢病毒，目前已能夠成功感染貼壁細(xì)胞并實現(xiàn)穩(wěn)定過表達QKI。
　　通過本課題的研究，首先，我們加深了對造血系統(tǒng)髓系分化的認(rèn)識，首次提出RNA結(jié)合蛋白在這一過程中發(fā)揮重要作用。它不僅是受髓系分化重要轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα直接調(diào)控的一個新的靶分子，還能夠直接對細(xì)胞因子受體CSF1R進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，決定單核/巨噬細(xì)胞能否正常分化；其次，進一步認(rèn)識了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)了QKI新的功能和作用機制；再次，鑒于C/EBPα