BCL11A在中國急性髓系白血病病人中的表達水平及其調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：選取5個急性髓系白血病(AML)相關基因，對新診斷的中國和歐洲血統(tǒng)占主要優(yōu)勢的西方AML患者進行基因突變差異比較。研究BCL11A在中國AML患者中的表達水平。對BCL11A上游調(diào)控機制進行深入研究，包括轉(zhuǎn)錄起始位點鑒定，啟動子活性分析，髓系分化關鍵調(diào)控因子CEBPα在BCL11A啟動子上結合位點的鑒定以及CEBPα對BCL11A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。進一步探討B(tài)CL11A在白血病發(fā)生過程中起到的致癌基因作用。
　　方法：⑴收集A

2、ML患者骨髓樣本269例，PCR擴增NF1，TP53，NRAS，F(xiàn)LT3，DNMT3A5個AML相關基因并進行測序鑒定，分析鑒定其突變情況。⑵TaqMan探針實時熒光定量方法，精確定量AML患者中BCL11A的表達水平，并與12例正常人骨髓樣本進行比較，分析其表達是否失調(diào)。⑶生物信息學分析及5'-RACE方法對BCL11A轉(zhuǎn)錄起始位點進行鑒定。⑷構建BCL11A啟動子及啟動子系列缺失體，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析啟動子活性。對活性顯

3、著的啟動子再次進行生物信息學分析，分析其可能的轉(zhuǎn)錄因子結合位點。⑸通過構建CEBPA相關表達載體，與BCL11A啟動子共轉(zhuǎn)染，CEBPA突變，啟動子結合位點突變等實驗鑒定CEBPα對BCL11A啟動子活性的影響。⑹通過過表達CEBPA實驗驗證其對內(nèi)源BCL11A表達的影響。⑺構建HL-60細胞分化模型，通過分化等實驗來研究ATRA誘導HL-60髓系分化過程中BCL11A所起的作用。
　　結果：①NF1，TP53，DNMT3A，NR

4、AS，F(xiàn)LT3在中國AML患者中的突變頻率分別為0，＜1％，6％，7％，23％。且這5個基因突變與臨床特征包括年齡、性別、FAB-type和細胞遺傳學等沒有顯著的聯(lián)系。除FLT3-ITD外，其余四個基因在中國AML患者中的突變頻率均低于歐洲血統(tǒng)占主要優(yōu)勢的西方AML患者。②BCL11A在中國AML患者中表達失調(diào)，表現(xiàn)出一定的高表達。③5'-RACE實驗發(fā)現(xiàn)BCL11A存在新轉(zhuǎn)錄起始位點，在NCBI公布的轉(zhuǎn)錄起始位點基礎上繼續(xù)向上游延伸1

5、42bp。④BCL11A新轉(zhuǎn)錄起始位點上游500bp堿基序列具有顯著的啟動子活性。⑤轉(zhuǎn)錄因子CEBPα抑制BCL11A啟動子活性，且抑制作用隨著CEBPA表達時間的延長和表達量的增加而加深。CEBPA基因突變后，抑制作用消失。對BCL11A啟動子上CEBPα可能的結合位點進行定點突變后，BCL11A啟動子活性上升約40％。⑥CEBPA過表達抑制內(nèi)源BCL11A表達。⑦HL-60細胞分化過程中，CEBPA表達水平上升，BCL11A表達水平

6、降低，兩者呈現(xiàn)負相關。而過表達BCL11A則會抑制HL-60細胞分化。
　　結論：本研究發(fā)現(xiàn)與西方研究相比，AML發(fā)生密切相關的基因在中國AML患者中突變頻率普遍偏低，提示在中國AML的發(fā)生發(fā)展中可能有其他基因通過其他尚未被發(fā)現(xiàn)的機制起作用。首次發(fā)現(xiàn)BCL11A在中國AML患者中表達失調(diào)。并在隨后的BCL11A分子遺傳調(diào)控網(wǎng)絡研究中鑒定了新的BCL11A轉(zhuǎn)錄起始位點，還首次發(fā)現(xiàn)髓系分化過程中關鍵的調(diào)控因子CEBPα可能作為一個主要