基于生物質(zhì)譜法的動(dòng)態(tài)突變和腫瘤標(biāo)志物相關(guān)分析方法研究.pdf

1、生物質(zhì)譜在醫(yī)療、醫(yī)藥、生物、環(huán)境、食品、臨床等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。研究表明，將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于核酸與蛋白的定性以及定量分析可以較為明顯的提高疾病檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低分析物的檢測(cè)下限，減少錯(cuò)誤率，因而亟需設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)代疾病與腫瘤的快速診斷篩查、治療監(jiān)測(cè)以及預(yù)后等方面。本論文將多種分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)與質(zhì)譜檢測(cè)手段聯(lián)用，以亨廷頓舞蹈癥、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)為檢測(cè)對(duì)象，開(kāi)發(fā)出具有一定

2、潛在利用價(jià)值的分析方法。本論文主要內(nèi)容簡(jiǎn)述如下:
　　1、基于PCR擴(kuò)增放大技術(shù)和鏈酶親和素磁珠與生物素的高特異性結(jié)合，提出了一種利用PCR放大、磁珠捕獲、酸水解單鏈DNA的核酸濃度分析方法[第2章]。以亨廷頓舞蹈癥為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的上下游引物來(lái)進(jìn)行目標(biāo)DNA鏈的擴(kuò)增，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)鏈的多重放大，再利用鏈酶親和素磁珠進(jìn)行目標(biāo)鏈的富集，除去未反應(yīng)的過(guò)量引物，并將DNA雙鏈變性成單鏈后酸水解目標(biāo)單鏈成為單個(gè)堿基后，以2μL定量

3、環(huán)固定于六通閥，CH3OH-H2O體系為流動(dòng)相注入質(zhì)譜中檢測(cè)。以待測(cè)物中天然存在的數(shù)目恒定的堿基胸腺嘧啶(T)為內(nèi)標(biāo)，質(zhì)譜信號(hào)最強(qiáng)的胞嘧啶(C)為質(zhì)譜信號(hào)記錄對(duì)象，根據(jù)不同CAG重復(fù)數(shù)DNA水解液在質(zhì)譜中胞嘧啶(C)信號(hào)的差異，在MS/MS模式下進(jìn)行二級(jí)子離子的數(shù)據(jù)記錄，得到的數(shù)據(jù)以胞嘧啶(C)/胸腺嘧啶(T)信號(hào)為縱坐標(biāo)，CAG重復(fù)序列重復(fù)數(shù)為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。然后從實(shí)際樣品血液中提取基因組DNA，在同樣的操作條件

4、下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)實(shí)際樣品的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限達(dá)到femto molar(fM)級(jí)。
　　2、基于磷脂合成脂質(zhì)體制備方法簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，具有良好的生物相容性等特點(diǎn)，以合成后的脂質(zhì)體包裹一定粒徑的納米金，將PEG-N3修飾的磷脂與DBCO-PEG4-NHS修飾的癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)特異性抗體通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，此時(shí)將蛋白G磁珠與抗體室溫孵育1h后加入目標(biāo)蛋白，最后加入合成好的脂質(zhì)體-抗體復(fù)合物，通

5、過(guò)特異性抗體識(shí)別抗原實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的捕獲，最終形成抗體-抗原-抗體的“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，除掉未反應(yīng)物質(zhì)后， MADLI-TOF-MS點(diǎn)樣檢測(cè)[第3章]。基于質(zhì)譜對(duì)磷脂的離子化效率高且容易檢測(cè)，通過(guò)對(duì)與抗體結(jié)合的磷脂的檢測(cè)間接實(shí)現(xiàn)癌胚抗原(CEA)，前列腺特異性抗原(PSA)兩種蛋白檢測(cè)，兩種蛋白的檢測(cè)可同時(shí)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)證明，本章實(shí)驗(yàn)方法特異性好，不受其他蛋白干擾，以點(diǎn)樣加入的濃度相同的磷脂為內(nèi)標(biāo)對(duì)不同濃度的抗原分析物進(jìn)行定量，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲