基于生物質(zhì)譜法的動態(tài)突變和腫瘤標志物相關分析方法研究.pdf

1、生物質(zhì)譜在醫(yī)療、醫(yī)藥、生物、環(huán)境、食品、臨床等領域具有廣泛的應用前景。研究表明，將質(zhì)譜技術應用于核酸與蛋白的定性以及定量分析可以較為明顯的提高疾病檢測結果的準確性，降低分析物的檢測下限，減少錯誤率，因而亟需設計簡單快速準確的實驗方案來實現(xiàn)對現(xiàn)代疾病與腫瘤的快速診斷篩查、治療監(jiān)測以及預后等方面。本論文將多種分子生物學技術、免疫學技術與質(zhì)譜檢測手段聯(lián)用，以亨廷頓舞蹈癥、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)為檢測對象，開發(fā)出具有一定

2、潛在利用價值的分析方法。本論文主要內(nèi)容簡述如下:
　　1、基于PCR擴增放大技術和鏈酶親和素磁珠與生物素的高特異性結合，提出了一種利用PCR放大、磁珠捕獲、酸水解單鏈DNA的核酸濃度分析方法[第2章]。以亨廷頓舞蹈癥為研究對象，通過設計特異性的上下游引物來進行目標DNA鏈的擴增，來實現(xiàn)對目標鏈的多重放大，再利用鏈酶親和素磁珠進行目標鏈的富集，除去未反應的過量引物，并將DNA雙鏈變性成單鏈后酸水解目標單鏈成為單個堿基后，以2μL定量

3、環(huán)固定于六通閥，CH3OH-H2O體系為流動相注入質(zhì)譜中檢測。以待測物中天然存在的數(shù)目恒定的堿基胸腺嘧啶(T)為內(nèi)標，質(zhì)譜信號最強的胞嘧啶(C)為質(zhì)譜信號記錄對象，根據(jù)不同CAG重復數(shù)DNA水解液在質(zhì)譜中胞嘧啶(C)信號的差異，在MS/MS模式下進行二級子離子的數(shù)據(jù)記錄，得到的數(shù)據(jù)以胞嘧啶(C)/胸腺嘧啶(T)信號為縱坐標，CAG重復序列重復數(shù)為橫坐標建立標準曲線，進而實現(xiàn)定量檢測。然后從實際樣品血液中提取基因組DNA，在同樣的操作條件

4、下，實現(xiàn)了對實際樣品的靈敏檢測，檢測下限達到femto molar(fM)級。
　　2、基于磷脂合成脂質(zhì)體制備方法簡單，穩(wěn)定性好，具有良好的生物相容性等特點，以合成后的脂質(zhì)體包裹一定粒徑的納米金，將PEG-N3修飾的磷脂與DBCO-PEG4-NHS修飾的癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原(PSA)特異性抗體通過點擊化學交聯(lián)，形成穩(wěn)定的復合物，此時將蛋白G磁珠與抗體室溫孵育1h后加入目標蛋白，最后加入合成好的脂質(zhì)體-抗體復合物，通

5、過特異性抗體識別抗原實現(xiàn)對目標蛋白的捕獲，最終形成抗體-抗原-抗體的“三明治”夾心結構，除掉未反應物質(zhì)后， MADLI-TOF-MS點樣檢測[第3章]。基于質(zhì)譜對磷脂的離子化效率高且容易檢測，通過對與抗體結合的磷脂的檢測間接實現(xiàn)癌胚抗原(CEA)，前列腺特異性抗原(PSA)兩種蛋白檢測，兩種蛋白的檢測可同時進行。實驗證明，本章實驗方法特異性好，不受其他蛋白干擾，以點樣加入的濃度相同的磷脂為內(nèi)標對不同濃度的抗原分析物進行定量，并建立標準曲