Csk-Src-EGFR參與調(diào)節(jié)肺肌成纖維細胞定向遷移及肺泡化過程.pdf

1、目的：支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產(chǎn)兒中最常見的慢性肺部疾病。其肺組織病理主要表現(xiàn)出次級分隔縮短、肺泡數(shù)目減少、體積增大及結(jié)構(gòu)簡單化等肺泡化阻滯的現(xiàn)象。胎兒未成熟的肺暴露于宮內(nèi)炎性環(huán)境中，是 BPD發(fā)生的重要危險因素。在肺泡化進程中，位于次級分隔頂端的肌成纖維細胞起重要作用。它能分泌彈性蛋白等基質(zhì)成分，促進次級分隔延伸、成熟，最終將囊泡分隔、重塑形成肺泡。前期試驗中，我們通過孕鼠羊

2、膜腔注射脂多糖（LPS）建立新生大鼠BPD模型，發(fā)現(xiàn)了肺組織中肌成纖維細胞分布異常。在此基礎上，我們進一步探索LPS是否影響了肺組織肌成纖維細胞的定向遷移，從而引起其在肺組織中的分布異常，導致肺泡化阻滯的發(fā)生，并探討Csk/Src/EGFR信號傳導在LPS引起肌成纖維細胞定向遷移受損中的作用。
　　方法：⑴孕16.5天的SD大鼠羊膜腔注射LPS后待其自然分娩，取7天新生鼠肺組織，提取原代肺肌成纖維細胞。通過高爾基體極性實驗和 Tr

3、answell細胞遷移實驗觀察肌成纖維細胞的定向遷移能力是否受損。同時，體外培養(yǎng)人胚肺肌成纖維細胞，觀察 LPS刺激后，細胞定向遷移能力的變化。⑵提取羊膜腔注射 LPS的新生鼠肺組織原代肌成纖維細胞，Western Blot檢測細胞中Csk，Src，EGFR蛋白的表達水平，以及Src和EGFR的磷酸化水平，觀察其是否被激活；用Csk活性試劑盒檢測細胞中Csk的活性。并觀察LPS體外刺激人胚肺肌成纖維細胞后，細胞中Csk，Src，EGFR

4、活性的變化。⑶體外培養(yǎng)人胚肺肌成纖維細胞，觀察加入外源性rhTGF-α刺激或者用 EGFR特異性抑制劑 AG1478預處理細胞后，細胞定向遷移能力的改變，探討LPS是否通過EGFR影響細胞的定向遷移。利用shRNA下調(diào)Csk表達，或者通過Src抑制劑PP1以及轉(zhuǎn)染Src負隱性（DN-Src）質(zhì)粒抑制Src激活，觀察LPS是否通過Csk/Src影響EGFR的激活以及細胞的定向遷移能力。⑷孕16.5天的SD大鼠羊膜腔同時注射LPS和EGFR

5、抑制劑Erlotinib，取7天新生鼠肺組織，HE染色觀察肺組織病理改變，免疫熒光染色觀察肌成纖維細胞的分布，探討Erlotinib是否改善了LPS引起的肺組織BPD病理改變和肌成纖維細胞分布異常。
　　結(jié)果：①羊膜腔注射LPS的新生大鼠肺組織肌成纖維細胞較注射生理鹽水的肺肌成纖維細胞高爾基體極化能力降低（74.39±0.6848％vs56.95±1.457%，p<0.01），細胞遷移減少（46.27±5.347 vs20.07±

6、4.631，p<0.05）。體外LPS刺激人胚肺肌成纖維細胞后，細胞的定向遷移能力同樣受損（高爾基體極化率降低：60.12±0.7442%vs41.65±0.7777%，p<0.01；遷移細胞數(shù)減少：37.6±1.208 vs19.6±0.8778，p<0.01）。②羊膜腔注射LPS的新生鼠肺組織原代肌成纖維細胞中各蛋白表達水平無明顯變化，但 Csk活性降低（降至73.6%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分別升高2.6倍，1.96倍

7、）。同樣的，體外LPS刺激人胚肺肌成纖維細胞30min后，細胞中Csk活性出現(xiàn)降低（降至70.3%），Src、EGFR磷酸化水平增高（分別升高2.2倍，1.5倍）。③加入 rhTGF-α刺激細胞后，觀察到與 LPS作用類似的高爾基體極化率降低，遷移細胞數(shù)減少的現(xiàn)象，表明細胞定向遷移能力受損。而EGFR抑制劑AG1478可以阻斷LPS或者TGF-α對細胞定向遷移的影響。用PP1抑制Src活性或者轉(zhuǎn)染DN-Src質(zhì)粒，則可阻斷LPS對細胞中

8、EGFR活性和細胞定向遷移能力的影響。進一步利用shRNA下調(diào)細胞中Csk表達后，也觀察到與LPS作用類似的EGFR活性增高，細胞定向遷移能力受損的現(xiàn)象。④羊膜腔同時注射LPS和EGFR抑制劑Erlotinib的肺組織較單獨注射LPS的肺組織中次級分隔數(shù)和終末肺泡數(shù)均有增高，分布在次級分隔的肌成纖維細胞也增多，Erlotinib改善了LPS引起的肺泡結(jié)構(gòu)簡單化和肺肌成纖維細胞分布異常的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)了炎癥引起支氣管肺發(fā)