Hedgehog通路參與bFGF促成纖維細(xì)胞遷移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討Hedgehog通路在bFGF促成纖維細(xì)胞遷移過程中的重要作用及潛在的分子機(jī)制。
　　方法：采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，3D球狀體侵襲實(shí)驗(yàn)，大鼠皮膚創(chuàng)傷模型來檢測成纖維細(xì)胞遷移，侵襲和皮膚創(chuàng)傷愈合的速度。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測受bFGF和Hh通路調(diào)控的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。運(yùn)用siRNA實(shí)驗(yàn)抑制內(nèi)源性的Smo， Gli1和β-catenin轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同時(shí)進(jìn)一步采用RNA深度測序、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和qRT-PCR分析技術(shù)檢測在β

2、-catenin干擾后，總轉(zhuǎn)錄組的變化情況及對Hh通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：提取bFGF處理后的成纖維細(xì)胞中的RNA進(jìn)行RNA測序。測序?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在bFGF處理后，Hh通路關(guān)鍵基因（包括SMO，Patch1，Gli1，Gli2， Gli3）的表達(dá)水平都發(fā)生了改變。并且發(fā)現(xiàn)用 SAG（Smo的激動劑，激活 Hh通路）能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移，侵襲和皮膚的創(chuàng)傷愈合，而Cyc（Cyclopamine， Smo的抑制劑，抑制

3、Hh通路）使成纖維細(xì)胞的遷移，侵襲和皮膚創(chuàng)傷愈合的速度都明顯減緩。GANT61（Gli1/Gli2的選擇性抑制劑）也能明顯抑制細(xì)胞的遷移，侵襲和皮膚的創(chuàng)傷愈合的速度。Western blot和siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， SAG能上調(diào)AKT和JNK的磷酸化水平及β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累量，證明Smo位于PI3K-JNK-β-catenin的上游，進(jìn)而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移。此外，RNA測序和qRT-PCR分析結(jié)果顯示，β-cat