HIF-1α與Notch作用在-1信號轉導通路的相互AD發(fā)病中的機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:本研究旨在應用ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系進行干預作為體外AD模型,進而探討缺氧誘導因子-1α與Notch-1信號通路的相互作用在阿爾茨海默?。ˋD)的發(fā)病中可能發(fā)揮的作用。
  方法:本研究應用Aβ寡聚體(ADDLs)對體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元與星形膠質細胞混合培養(yǎng)體系進行干預以模擬體外AD模型。采用細胞免疫熒光的方法鑒定混合體系中神經(jīng)元及星形膠質細胞中HIF-1α及Notch-1蛋白表達的情況;

2、應用HIF-1α誘導劑DMOG、HIF-1α抑制劑YC-1及Notch-1信號通路阻斷劑(γ-分泌酶抑制劑)DAPT對體外AD模型進行干預;應用CCK-8法對各種條件下體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元與星形膠質細胞混合體系的細胞活力進行檢測;應用Western Blot法對不同條件下混合體系的HIF-1α水平、NICD(Notch-1 intracellular domain,Notch-1胞內段)水平進行檢測,采用熒光實時定量PCR法對不同條件

3、下混合體系中凋亡相關蛋白caspase-3的mRNA水平進行檢測。
  結果:首先HIF-1α在原代培養(yǎng)混合體系的部分神經(jīng)元和部分星形膠質細胞中存在表達,而Notch-1則主要在大部分星形膠質細胞中存在表達,皮層神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)明確表達;其次,CCK-8實驗顯示,相對低濃度的ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系的細胞活力無顯著影響,但ADDLs在較高濃度情況下對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力則表現(xiàn)出明顯的毒性作用,并

4、且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。伴隨著這種毒性作用,ADDLs的干預使得原代培養(yǎng)混合體系的HIF-1α及NICD水平均呈現(xiàn)出先升高后減低的類似變化趨勢。針對以上毒性作用,YC-1及DAPT在4小時點對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力表現(xiàn)出明顯的保護作用,并且可以明顯抑制ADDLs所誘導原代培養(yǎng)混合體系中凋亡相關蛋白caspase-3 mRNA的表達水平,同時YC-1及DAPT顯著抑制了ADDLs誘導的原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平的上調

5、。YC-1及DAPT在24小時點對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力、HIF-1α及NICD水平的影響不明顯。
  結論:Aβ寡聚體(ADDLs)的毒性作用和HIF-1α及NICD水平的一過性上調有關,同時HIF-1α和Notch-1信號通路的相互作用與ADDLs的毒性作用有密切關系;YC-1及DAPT均可拮抗ADDLs的毒性作用及凋亡誘導作用,這些保護作用可能與調節(jié)HIF-1α及Notch-1信號通路的相互作用密切相關。
  本文

6、分三個部分具體探討:
  第一部分:ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系細胞活力及HIF-1α、NICD水平的影響
  目的:應用ADDLs干預原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系以建立體外AD模型,并探討ADDLs對此體外AD模型中HIF-1α及NICD水平的影響。
  方法:原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系,應用細胞免疫熒光的方法鑒定原代混合體系中HIF-1α及Notch-1

7、在神經(jīng)元及星形膠質細胞中的表達情況;制備ADDLs并以其干預原代培養(yǎng)混合體系從而模擬體外AD模型;應用CCK-8法對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力進行檢測,并應用Western blotting對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD水平進行檢測。作為補充,還應用RT-PCR法對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進行了檢測。
  結果:在原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系中,

8、HIF-1α在部分神經(jīng)元及部分星形膠質細胞中表達,而Notch-1則在大部分星形膠質細胞中表達,而在神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)Notch-1的明確表達;低濃度ADDLs(<2μmol/L)對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力無顯著影響,而高濃度ADDLs(≥2μmol/L)則對原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力表現(xiàn)出濃度及干預時間依賴性的損害,同時10μmol/L的ADDLs干預后原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平均表現(xiàn)出先升高后減低的變化趨勢。另外,1

9、0μmol/L的ADDLs干預4小時后,混合體系的caspase-3 mRNA水平顯著升高,而24小時點的caspase-3 mRNA水平較4小時點卻是無顯著改變。
  結論:ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系具有濃度和時間相關的毒性作用。而ADDLs所表現(xiàn)的這種毒性作用可能與原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平的一過性升高有關。
  第二部分:YC-1對體外AD模型的保護作用及HIF-1α、N

10、ICD蛋白水平的影響
  目的:探討ADDLs干預誘導的體外AD模型中YC-1的保護作用及其對HIF-1α、NICD蛋白水平的影響。
  方法:應用ADDLs干預原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系從而模擬體外AD模型,應用YC-1及DMOG對此體外AD模型進行干預。采用CCK-8法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力進行檢測;利用Western blot法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD蛋白

11、水平進行檢測;應用RT-PCR對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進行檢測。
  結果:在ADDLs干預4小時點,YC-1可以顯著緩解體外AD模型中ADDLs所誘導減低的細胞活力,還可顯著緩解原代培養(yǎng)混合體系中ADDLs誘導的凋亡相關蛋白caspase-3 mRNA水平升高,同時YC-1還顯著減低了ADDLs所誘導AD模型中HIF-1α及NICD蛋白水平的上調。而在ADDLs干預24小時點,YC-1對體外

12、AD模型的細胞活力無顯著影響,同時其對模型中caspase-3的mRNA水平及HIF-1α及NICD蛋白水平均未表現(xiàn)出顯著影響。
  結論:在原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞中,YC-1針對ADDLs所誘導的毒性作用具有明顯的保護作用,而這種保護作用可能與抑制 ADDLs所誘導的HIF-1α及NICD一過性升高密切相關。
  第三部分:DAPT對體外AD模型的保護作用及HIF-1α、NICD蛋白水平的影響
  目的

13、:探討ADDLs干預誘導的體外AD模型中DAPT的保護作用及其對HIF-1α、NICD蛋白水平的影響。
  方法:應用ADDLs干預原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質細胞混合體系從而模擬體外AD模型,應用DAPT對此體外AD模型進行干預。采用CCK-8法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系的細胞活力進行檢測;利用Western blot法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD蛋白水平進行檢測;應用RT-PCR對不同條件下原代

14、培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進行檢測。
  結果:在ADDLs干預4小時點,DAPT可以顯著緩解體外AD模型中ADDLs所誘導減低的細胞活力,還可顯著緩解原代培養(yǎng)混合體系中ADDLs誘導的凋亡相關蛋白caspase-3 mRNA水平升高,同時DAPT還顯著減低了ADDLs所誘導AD模型中HIF-1α及NICD蛋白水平的上調。而在ADDLs干預24小時點, DAPT對體外AD模型的細胞活力無顯著影響,同時其對模型中

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