HIF-1α與Notch作用在-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互AD發(fā)病中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究旨在應(yīng)用ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系進(jìn)行干預(yù)作為體外AD模型，進(jìn)而探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α與Notch-1信號通路的相互作用在阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病中可能發(fā)揮的作用。
　　方法：本研究應(yīng)用Aβ寡聚體（ADDLs）對體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系進(jìn)行干預(yù)以模擬體外AD模型。采用細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定混合體系中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α及Notch-1蛋白表達(dá)的情況；

2、應(yīng)用HIF-1α誘導(dǎo)劑DMOG、HIF-1α抑制劑YC-1及Notch-1信號通路阻斷劑（γ-分泌酶抑制劑）DAPT對體外AD模型進(jìn)行干預(yù)；應(yīng)用CCK-8法對各種條件下體外培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測；應(yīng)用Western Blot法對不同條件下混合體系的HIF-1α水平、NICD（Notch-1 intracellular domain，Notch-1胞內(nèi)段）水平進(jìn)行檢測，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對不同條件

3、下混合體系中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的mRNA水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：首先HIF-1α在原代培養(yǎng)混合體系的部分神經(jīng)元和部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在表達(dá)，而Notch-1則主要在大部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中存在表達(dá)，皮層神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)明確表達(dá)；其次，CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，相對低濃度的ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系的細(xì)胞活力無顯著影響，但ADDLs在較高濃度情況下對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力則表現(xiàn)出明顯的毒性作用，并

4、且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。伴隨著這種毒性作用，ADDLs的干預(yù)使得原代培養(yǎng)混合體系的HIF-1α及NICD水平均呈現(xiàn)出先升高后減低的類似變化趨勢。針對以上毒性作用，YC-1及DAPT在4小時(shí)點(diǎn)對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，并且可以明顯抑制ADDLs所誘導(dǎo)原代培養(yǎng)混合體系中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)YC-1及DAPT顯著抑制了ADDLs誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平的上調(diào)

5、。YC-1及DAPT在24小時(shí)點(diǎn)對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力、HIF-1α及NICD水平的影響不明顯。
　　結(jié)論：Aβ寡聚體（ADDLs）的毒性作用和HIF-1α及NICD水平的一過性上調(diào)有關(guān)，同時(shí)HIF-1α和Notch-1信號通路的相互作用與ADDLs的毒性作用有密切關(guān)系；YC-1及DAPT均可拮抗ADDLs的毒性作用及凋亡誘導(dǎo)作用，這些保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)HIF-1α及Notch-1信號通路的相互作用密切相關(guān)。
　　本文

6、分三個(gè)部分具體探討：
　　第一部分：ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系細(xì)胞活力及HIF-1α、NICD水平的影響
　　目的：應(yīng)用ADDLs干預(yù)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系以建立體外AD模型，并探討ADDLs對此體外AD模型中HIF-1α及NICD水平的影響。
　　方法：原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光的方法鑒定原代混合體系中HIF-1α及Notch-1

7、在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況；制備ADDLs并以其干預(yù)原代培養(yǎng)混合體系從而模擬體外AD模型；應(yīng)用CCK-8法對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，并應(yīng)用Western blotting對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD水平進(jìn)行檢測。作為補(bǔ)充，還應(yīng)用RT-PCR法對不同狀況下原代培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進(jìn)行了檢測。
　　結(jié)果：在原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系中，

8、HIF-1α在部分神經(jīng)元及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而Notch-1則在大部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而在神經(jīng)元中未發(fā)現(xiàn)Notch-1的明確表達(dá)；低濃度ADDLs（＜2μmol/L）對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力無顯著影響，而高濃度ADDLs（≥2μmol/L）則對原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力表現(xiàn)出濃度及干預(yù)時(shí)間依賴性的損害，同時(shí)10μmol/L的ADDLs干預(yù)后原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平均表現(xiàn)出先升高后減低的變化趨勢。另外，1

9、0μmol/L的ADDLs干預(yù)4小時(shí)后，混合體系的caspase-3 mRNA水平顯著升高，而24小時(shí)點(diǎn)的caspase-3 mRNA水平較4小時(shí)點(diǎn)卻是無顯著改變。
　　結(jié)論：ADDLs對原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系具有濃度和時(shí)間相關(guān)的毒性作用。而ADDLs所表現(xiàn)的這種毒性作用可能與原代培養(yǎng)混合體系中HIF-1α及NICD水平的一過性升高有關(guān)。
　　第二部分：YC-1對體外AD模型的保護(hù)作用及HIF-1α、N

10、ICD蛋白水平的影響
　　目的：探討ADDLs干預(yù)誘導(dǎo)的體外AD模型中YC-1的保護(hù)作用及其對HIF-1α、NICD蛋白水平的影響。
　　方法：應(yīng)用ADDLs干預(yù)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系從而模擬體外AD模型，應(yīng)用YC-1及DMOG對此體外AD模型進(jìn)行干預(yù)。采用CCK-8法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測；利用Western blot法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD蛋白

11、水平進(jìn)行檢測；應(yīng)用RT-PCR對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：在ADDLs干預(yù)4小時(shí)點(diǎn)，YC-1可以顯著緩解體外AD模型中ADDLs所誘導(dǎo)減低的細(xì)胞活力，還可顯著緩解原代培養(yǎng)混合體系中ADDLs誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 mRNA水平升高，同時(shí)YC-1還顯著減低了ADDLs所誘導(dǎo)AD模型中HIF-1α及NICD蛋白水平的上調(diào)。而在ADDLs干預(yù)24小時(shí)點(diǎn)，YC-1對體外

12、AD模型的細(xì)胞活力無顯著影響，同時(shí)其對模型中caspase-3的mRNA水平及HIF-1α及NICD蛋白水平均未表現(xiàn)出顯著影響。
　　結(jié)論：在原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中，YC-1針對ADDLs所誘導(dǎo)的毒性作用具有明顯的保護(hù)作用，而這種保護(hù)作用可能與抑制 ADDLs所誘導(dǎo)的HIF-1α及NICD一過性升高密切相關(guān)。
　　第三部分：DAPT對體外AD模型的保護(hù)作用及HIF-1α、NICD蛋白水平的影響
　　目的

13、：探討ADDLs干預(yù)誘導(dǎo)的體外AD模型中DAPT的保護(hù)作用及其對HIF-1α、NICD蛋白水平的影響。
　　方法：應(yīng)用ADDLs干預(yù)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞混合體系從而模擬體外AD模型，應(yīng)用DAPT對此體外AD模型進(jìn)行干預(yù)。采用CCK-8法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測；利用Western blot法對不同條件下原代培養(yǎng)混合體系中的HIF-1α及NICD蛋白水平進(jìn)行檢測；應(yīng)用RT-PCR對不同條件下原代

14、培養(yǎng)混合體系中caspase-3的mRNA水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：在ADDLs干預(yù)4小時(shí)點(diǎn)，DAPT可以顯著緩解體外AD模型中ADDLs所誘導(dǎo)減低的細(xì)胞活力，還可顯著緩解原代培養(yǎng)混合體系中ADDLs誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 mRNA水平升高，同時(shí)DAPT還顯著減低了ADDLs所誘導(dǎo)AD模型中HIF-1α及NICD蛋白水平的上調(diào)。而在ADDLs干預(yù)24小時(shí)點(diǎn)， DAPT對體外AD模型的細(xì)胞活力無顯著影響，同時(shí)其對模型中