急性白血病細(xì)胞TGF—β及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因差異表達(dá)研究.pdf

1、急性白血病(acute leukemia，AL)是一種造血干細(xì)胞惡性增殖的克隆性疾病。TGF-β1是目前已知的最強(qiáng)的血細(xì)胞抑制因子，它對(duì)于維持造血干祖細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，抑制過(guò)度增殖，誘導(dǎo)分化和促進(jìn)凋亡有重要作用。大量實(shí)體瘤的研究表明TGF-β、TGF-βR、Smads蛋白與靶基因共同構(gòu)成腫瘤抑制通路，任一成分缺陷都會(huì)導(dǎo)致TGF-β的生長(zhǎng)抑制作用喪失，細(xì)胞惡性增殖。血液系統(tǒng)腫瘤存在著與實(shí)體瘤類似的情況，TrGF-β/Smads信號(hào)通路異常

2、可造成細(xì)胞失去對(duì)TGF-β的敏感性，生長(zhǎng)失控，分化凋亡受阻，最終惡性增殖。我們課題組己在這方面開(kāi)展了若干研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)正常造血干細(xì)胞表達(dá)多種正性自分泌因子。隨著細(xì)胞分化成熟，粒細(xì)胞、血小板正性自分泌因子表達(dá)逐漸減少。而TGF-β1則持續(xù)表達(dá)。因此，我們提出內(nèi)源性TGF-β1;是促進(jìn)血細(xì)胞分化凋亡的內(nèi)在動(dòng)力。為證實(shí)上述假說(shuō)，我們進(jìn)一步應(yīng)用維甲酸、野生型P53基因、亞砷酸誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株，HL60細(xì)胞分化或凋亡模型表達(dá)TGF-β1

3、mRNA上調(diào)。應(yīng)用TGF-β1反義PS-ODN阻斷內(nèi)源性TGF-β1的表達(dá)，則能抵抗維甲酸、野生型P53基因、亞砷酸誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞分化與凋亡。研究還發(fā)現(xiàn)急性白血病患者血清中TGF一β1水平明顯減低，經(jīng)治療獲緩解后其水平恢復(fù)正常，復(fù)發(fā)患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代細(xì)胞和細(xì)胞株培養(yǎng)上清TGF-β1水平與正常細(xì)胞相比有明顯下降。國(guó)內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因Smad4、IL6表達(dá)的缺失或突變與急性白血病的發(fā)生密切相

4、關(guān)；Smad7參與K562細(xì)胞TGF-β信號(hào)的傳導(dǎo)，Smad7與TGF-β1之間存在自身調(diào)節(jié)負(fù)反饋通路；對(duì)HL60細(xì)胞加入c-MYC反義寡脫氧核苷酸抑制MYC基因表達(dá)可誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡；美國(guó)國(guó)立癌癥研究院(national cancetinstitute，NCI)研究發(fā)現(xiàn)兒童T淋巴細(xì)胞白血病患者存在Smad3蛋白缺失，導(dǎo)致TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，在兒童T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病中起重要作用。 然而導(dǎo)致急性白血病患者TGF-β

5、1水平下降的原因以及TFGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與急性白血病關(guān)系具體機(jī)制目前不清楚。本課題㈠首先采用熒光定量。PCR技術(shù)檢測(cè)急性B淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia B，B-ALL)原代細(xì)胞及細(xì)胞株、急性髓細(xì)胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)原代細(xì)胞及細(xì)胞株TGF-β1mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步應(yīng)用TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因芯片分別檢測(cè)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相

6、關(guān)基因表達(dá)水平，篩選出較正常對(duì)照表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)的基因；㈡建立亞砷酸誘導(dǎo)HL60細(xì)胞、NB4細(xì)胞凋亡模型，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TGF-β1mR_NA表達(dá)水平及TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因芯片檢測(cè)其TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)水平；㈢采用反義PS-ODN干預(yù)急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株NALM6細(xì)胞，Rmji細(xì)胞后檢測(cè)其對(duì)上調(diào)基因的表達(dá)TGF-β1mRNA表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果總結(jié)如下： (1)熒光定量PCR技術(shù)檢

7、測(cè)B-ALL細(xì)胞、AML細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照明顯減低，使用人TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因芯片對(duì)B-ALL細(xì)胞檢測(cè)其TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)水平，篩選出較正常對(duì)照基因MYC、Smad1表達(dá)明顯上調(diào)，基因IL6、Smad7下調(diào)；對(duì)AML細(xì)胞檢測(cè)其TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)水平，篩選出較正常對(duì)照基因IL6、Smad7表達(dá)明顯下調(diào)。 (2)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)經(jīng)過(guò)亞砷酸(As2O3)誘

8、導(dǎo)后HL-60細(xì)胞、NB4細(xì)胞TGF-βm1RNA表達(dá)水平較對(duì)照明顯增高，使用人TGF-β/BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因芯片分別對(duì)經(jīng)過(guò)AszO3誘導(dǎo)前后HL-60細(xì)胞、NB4細(xì)胞檢測(cè)其TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)水平，其誘導(dǎo)后HL-60細(xì)胞、NB4細(xì)胞較對(duì)照表達(dá)明顯上調(diào)基因IL6、Smad7，下調(diào)基因MYC。 (3)加入MYC、Smad1基因AS-PS-ODNS后NALM6細(xì)胞、Rmji細(xì)胞表達(dá)TGF-β1增高；Smad1、