氯化銨對(duì)人正常肝細(xì)胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達(dá)的影響.pdf

1、背景：
　　肝臟(liver)是人體內(nèi)最大的消化腺和最大的實(shí)質(zhì)性器官,肝臟的功能十分復(fù)雜、多樣，在人體的物質(zhì)代謝中占有極其重要的地位,其與三大有機(jī)物的代謝、轉(zhuǎn)化及解毒等機(jī)能密切相關(guān)[1]。當(dāng)各種原因引起肝臟發(fā)生嚴(yán)重病變時(shí)(如重癥肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌)，肝臟喪失合成和解毒功能導(dǎo)致黃疸,肝性腦病,凝血障礙,和多器官衰竭[2]嚴(yán)重威脅患者的生命。而血氨（blood ammonia,BA）升高在肝臟衰竭時(shí)較為常見(jiàn)，在近年來(lái)的臨床實(shí)踐中，

2、其對(duì)肝臟代謝能力的指示作用受到越拉越多的關(guān)注，血氨不僅對(duì)肝性腦病有診斷價(jià)值，其更能反應(yīng)出肝臟病變的嚴(yán)重程度。血氨其在人體中的主要來(lái)源主要有腸道分解產(chǎn)生、腎臟分泌產(chǎn)生以及肌肉產(chǎn)氨，是人體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物，人體中血氨的正常值為18～72umol/L[3]。肝臟是氨最為主要的代謝場(chǎng)所，正常情況下人體內(nèi)的氨主要在肝臟中通過(guò)尿素循環(huán)的途徑被合成尿素，而后隨尿液經(jīng)腎臟排出體外。而血氨在腦組織、心肌以及骨髂肌中則是由谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺，而

3、后生成的谷氨酰胺隨血液循環(huán)進(jìn)入到肝臟，經(jīng)由谷氨酰胺酶分解再次產(chǎn)生氨，最后，被分解出來(lái)的氨在肝細(xì)胞中參與尿素合成的鳥(niǎo)氨酸循環(huán)。而谷氨酰胺在肝細(xì)胞液內(nèi)也可經(jīng)由CPSII途徑參與嘧啶的從頭合成，是細(xì)胞內(nèi)DNA及RNA合成的基本原料。
　　當(dāng)肝臟由于病變受到損傷時(shí)，將會(huì)影響肝臟本身的代謝能力，使其無(wú)法有效地將人體內(nèi)產(chǎn)生的氨代謝出去，從而導(dǎo)致氨在體內(nèi)不斷蓄積，氨對(duì)人體有很大的毒性作用，如不能及時(shí)將其轉(zhuǎn)化為無(wú)毒或者毒性較小的產(chǎn)物代謝出去將會(huì)進(jìn)

4、一步加重肝臟損傷，出現(xiàn)更嚴(yán)重的并發(fā)癥（如肝性腦?。?，甚至誘發(fā)肝衰竭。而肝衰竭發(fā)生后，肝細(xì)胞大量的壞死和凋亡，細(xì)胞正常的功能?chē)?yán)重受損，但“殘存”的肝細(xì)胞無(wú)法通過(guò)代償來(lái)滿足人體正常的需要從而導(dǎo)致一系列的功能紊亂，包括血氨升高，出現(xiàn)乳酸酸中毒，糖代謝紊亂以及吲哚水平升高等。而氨在體內(nèi)蓄積后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①氨可以引起體內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生腫脹；研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹是急性肝衰竭時(shí)腦水腫發(fā)生的重要的病理指標(biāo)。②氨能夠

5、引起線粒體的通透性發(fā)生轉(zhuǎn)換。③氨同樣可以引起細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)障礙。④由氨引起的氧化應(yīng)激效應(yīng)[4-6]。既往對(duì)高血氨的研究主要著眼于氨對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用,即肝性腦病的研究,目前關(guān)于肝性腦病的發(fā)病機(jī)制研究主要有:氨中毒學(xué)說(shuō)、血漿中的氨基酸代謝學(xué)說(shuō)、假性遞質(zhì)學(xué)說(shuō)等，以及多種毒素在體內(nèi)共同作用，相互影響，互為因果，共同促進(jìn)感性腦病的發(fā)生和進(jìn)展[7、8]。其中圍繞氨中毒這一學(xué)說(shuō)進(jìn)行的研究最多。在腦組織中血氨主要依靠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)部的谷氨酰胺合成

6、酶來(lái)完成代謝，然而星形膠質(zhì)細(xì)胞也是氨產(chǎn)生神經(jīng)毒性主要的靶細(xì)胞，氨可以通過(guò)通過(guò)多種途徑引起腦水腫并改變基因表達(dá)，最終的結(jié)果是神經(jīng)元失去了星形膠質(zhì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)支持作用，從而引發(fā)肝性腦病。
　　通過(guò)臨床實(shí)踐我們發(fā)現(xiàn)，在以“二次打擊學(xué)說(shuō)”為基礎(chǔ)，給予相同的抗病毒、保肝、利尿等基礎(chǔ)治的同時(shí)，采用全程門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸治療可以明顯延緩乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭的病情進(jìn)展[9]，通過(guò)降低患者體內(nèi)血氨水平明顯緩解了肝臟損傷，極大的促進(jìn)了肝細(xì)胞的分泌、解毒、

7、合成及轉(zhuǎn)化等功能，能夠降低病死率，改善患者預(yù)后。而隨著降血氨藥物的應(yīng)用，患者血清膽紅素水平也隨之下降，二者之間有相關(guān)性。隨后進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí),使用氯化銨對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理構(gòu)建高血氨模型后,能夠觀察到血氨可以直接通過(guò)肝細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)肝損傷,其機(jī)制可能是通過(guò)影響基因的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的[10]。同樣用氯化銨處理人正常肝細(xì)胞后可以發(fā)現(xiàn)氯化銨可以明顯抑制正常肝細(xì)胞的生長(zhǎng)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，氨可以通過(guò)干擾正常肝細(xì)胞內(nèi)的能量代謝來(lái)干擾膽紅素的代謝過(guò)程[

8、11]。代謝組學(xué)研究表明氯化銨處理后的肝細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺水平增加，而細(xì)胞內(nèi) RNA合成的卻受到抑制，合成原料增加而產(chǎn)物卻減少，進(jìn)一步的結(jié)果表明作為嘧啶從頭合成的重要中間產(chǎn)物乳清酸的合成也受到抑制，這可能是RNA合成受到抑制的關(guān)鍵所在，但具體的機(jī)制尚不明確，我們推測(cè)可能是氯化銨抑制了能夠催化合成乳清酸的二氫乳清酸脫氫酶。因此我們希望通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)探明這一現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，有助于我們深層次的認(rèn)識(shí)肝衰竭的發(fā)生機(jī)制，為肝衰竭的治療提供新的理論基礎(chǔ)。<

9、br>　　目的：
　　檢驗(yàn)氯化銨處理人正常肝細(xì)胞后，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)以及與乳清酸合成有關(guān)的二氫乳清酸脫氫酶表達(dá)發(fā)生的變化。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞系（changliver）,給予 NH4CL(1.25、2.5、5、1 O、20、40和80mmol/L)刺激細(xì)胞12、24、48小時(shí)后，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)經(jīng)5、10、20 mmol/L的NH4Cl刺激24小時(shí)后chang

10、liver細(xì)胞凋亡情況。
　　3.Realtime-PCR方法檢測(cè)經(jīng)5、10、20 mmol/L的NH4Cl刺激12、24、48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)二氫乳清酸脫氫酶mRNA的表達(dá)。
　　4. Western-blotting方法檢測(cè)經(jīng)5、10、20 mmol/L的NH4CL刺激12、24、48小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)二氫乳清酸脫氫酶蛋白的表達(dá)。
　　5.采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（?x±s）來(lái)

11、表示；數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的多組之間的比較采用方差分析；分類(lèi)資料用 R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1. CCK-8結(jié)果示NH4CL能夠抑制changliver細(xì)胞的增殖，且隨著NH4CL濃度的增加，其對(duì)changliver細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增加。
　　2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，在5、10、20 mmol/L的NH4CL濃度

12、梯度下刺激24小時(shí)后，changliver細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，且NH4CL濃度越高，凋亡越明顯。
　　3.Realtime-PCR結(jié)果表明，在5、10、20 mmol/L的NH4CL濃度梯度下刺激12、24、48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)二氫乳清酸脫氫酶 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少（p<0.05）；
　　4. Western-blot結(jié)果表明在5、10、20 mmol/L的NH4CL濃度梯度下刺激12、24、48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)二

13、氫乳清酸脫氫酶蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組明顯減少（p<0.05）；
　　結(jié)論：
　　1. NH4CL能夠抑制changliver細(xì)胞的增殖，且隨著NH4CL濃度的增加，其對(duì)changliver細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增加。
　　2. NH4CL能夠引起changliver細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著NH4CL濃度的增加，凋亡越明顯。
　　3. NH4CL能夠抑制changliver細(xì)胞中的二氫乳清酸脫氫酶的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致乳清酸合成減