矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對(duì)APPswe-PS1ΔE9轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制及對(duì)其腸道菌群的影響.pdf

1、目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以記憶喪失和認(rèn)知衰退為主要臨床癥狀的大腦神經(jīng)退行性疾病。特征性的病理學(xué)表現(xiàn)有:β淀粉樣肽(β amyloidpeptides，Aβ)沉積形成的老年斑和tau蛋白過(guò)度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。目前有關(guān)AD的病因仍然不明確，臨床上無(wú)有效的防治措施并且已有的臨床治療藥物還存在毒副作用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，天然植物化學(xué)物——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)可以用于緩

2、解包括AD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病，但其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚未具體闡明，特別是由Cy3G觸發(fā)的下游分子靶標(biāo)尚未確定。在非酒精性脂肪肝、2-型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，Cy3G可以通過(guò)活化過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路調(diào)節(jié)脂代謝、改善胰島素抵抗、緩解氧化應(yīng)激。因此，本課題擬通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討Cy3G是否通過(guò)上調(diào)PPARγ進(jìn)而影響其下游相關(guān)的蛋白從而改善AD的認(rèn)知功能;另外，還探討了Cy3G對(duì)AD腸道微生物菌群的影響，以期能為

3、Cy3G改善AD認(rèn)知的機(jī)制研究及潛在臨床應(yīng)用提供新的思路。
　　方法：首先，采用β-淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作為AD細(xì)胞模型，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步探討Cy3G是否通過(guò)上調(diào)PPARγ蛋白水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。應(yīng)用MTT法檢測(cè)不同化合物對(duì)細(xì)胞活力的影響及Cy3G對(duì)Aβ25-35致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并在此基礎(chǔ)上，分別設(shè)立對(duì)照組（Control，未加任何處理因素），Aβ25-35損傷組

4、（10μM的Aβ25-35損傷24h），Cy3G組（25μM的Cy3G孵育24h），(Cy3G+Aβ25-35)組（25μM的Cy3G孵育24h，再給與10μM的Aβ25-35繼續(xù)損傷24h），(GW9662+Cy3G)組（20μM的GW9662預(yù)孵育3h，再與25μM的Cy3G共孵育24h）以及GW9662拮抗劑組（20μM的GW9662預(yù)孵育3h，再與25μM的Cy3G共孵育24h，最后加入10μM的Aβ25-35繼續(xù)損傷24h）。

5、使用透射電鏡觀察Cy3G對(duì)細(xì)胞膜和亞細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)以及對(duì)Aβ25-35寡聚體和纖維結(jié)構(gòu)自發(fā)聚集過(guò)程的影響;使用剛果紅染色(CR)和掃描電鏡觀察Cy3G對(duì)Aβ25-35與細(xì)胞膜結(jié)合的影響;利用Hoechst33258和DCFH-DA熒光探針?lè)謩e檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)生成情況，并通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析;使用免疫印跡法檢測(cè)PPARγ蛋白的表達(dá)水平。
　　其次，從整體水平探討Cy3G對(duì)APPswe/PSI△E9(P

6、AP)轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠行為學(xué)、腦葡萄糖代謝、病理進(jìn)程等方面的影響，并進(jìn)一步驗(yàn)證Cy3G是否通過(guò)活化PPARγ從而發(fā)揮改善AD認(rèn)知的生物學(xué)效用。將7月齡的PAP轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型隨機(jī)分為AD模型組(PAP)、Cy3G治療組(PAPCy，5mg/kg/d)、GW9662拮抗劑組(PAPiCy，1mg/kg/d)及同窩陰性對(duì)照組(nPAP);另外選擇相同月齡的正常野生型C57BL/6J小鼠分別作為空白對(duì)照組(WT)和Cy3G干預(yù)組(WTCy

7、，5mg/kg/d);每組10～14只，雌雄各半，Cy3G灌胃8周。各組小鼠干預(yù)結(jié)束后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察Cy3G對(duì)AD模型小鼠自主活動(dòng)和認(rèn)知功能的影響;分別用血糖儀和小動(dòng)物MicroPET/CT檢測(cè)小鼠空腹血糖水平和腦葡萄糖代謝率;稱量主要臟器質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù);用生化方法檢測(cè)小鼠肝腎功能及脂代謝相關(guān)指標(biāo);應(yīng)用病理學(xué)檢測(cè)方法觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化及腦中老年斑生成情況;用免疫分析法檢測(cè)小鼠血清中胰

8、島素和瘦素水平變化;用免疫印跡法檢測(cè)PPARγ下游靶蛋白Akt、JNK和GSK-3β表達(dá)水平。
　　最后，在體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用基于16S rRNA的高通量測(cè)序技術(shù)，從腸道微生態(tài)方面，通過(guò)檢測(cè)小鼠結(jié)腸糞便中的微生物來(lái)探討Cy3G對(duì)AD模型小鼠腸道菌群豐度、多樣性及組成結(jié)構(gòu)的影響;并應(yīng)用病理學(xué)檢測(cè)方法觀察小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、病理生理學(xué)變化;利用Luminex xMAP(@)多因子檢測(cè)技術(shù)測(cè)定血清中與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)的指標(biāo)。
　　

9、結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Cy3G可以通過(guò)PPARγ途徑緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。即在分子水平上，Cy3G可以抑制Aβ25-35與細(xì)胞膜表面結(jié)合、阻止Aβ25-35寡聚體和纖維狀結(jié)構(gòu)的自發(fā)聚集;在細(xì)胞水平上，由Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，包括細(xì)胞凋亡水平升高、ROS生成增多，均可以被Cy3G所緩解;此外，Cy3G可以上調(diào)細(xì)胞核中介導(dǎo)糖/脂代謝的PPARγ蛋白的表達(dá)水平。而GW9662則抑制了Cy3G生物活

10、性效用的發(fā)揮，下調(diào)PPARγ蛋白的水平。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cy3G干預(yù)PAP小鼠8周后，能增加APPswe/PS1△E9轉(zhuǎn)基因AD小鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的識(shí)別指數(shù)，減少M(fèi)orris水迷宮隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中小鼠尋找平臺(tái)所用的潛伏期，增加空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)所在象限的次數(shù)和停留時(shí)間，但并不影響小鼠在曠場(chǎng)中的自主活動(dòng);Cy3G還可以降低PAP小鼠空腹血糖水平并改善腦（海馬和額葉皮層）葡萄糖代謝異常，有效緩解PAP小鼠的腦萎縮程度，抑

11、制腦中老年斑的形成，并能維持正常的脂代謝且無(wú)明顯的肝腎毒性損傷，降低腦組織中P-JNK蛋白的表達(dá)、增加P-Akt和P-GSK-3β蛋白的表達(dá);而GW9662可以阻斷Cy3G改善小鼠認(rèn)知功能損傷、糖脂代謝異常的生物學(xué)活性，但對(duì)Akt、JNK和GSK-3β蛋白表達(dá)無(wú)影響。
　　腸道微生態(tài)研究發(fā)現(xiàn)，AD小鼠腸道菌群群落豐度、多樣性及結(jié)構(gòu)都發(fā)生了顯著改變，這些菌群及其比例的改變可能與AD相關(guān)的病理和認(rèn)知功能改變有關(guān);Cy3G干預(yù)會(huì)使小鼠糞

12、便菌群多樣性和豐度均降低，特別是降低有害菌群——藍(lán)藻細(xì)菌的豐度、下調(diào)厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度比例，促進(jìn)變形菌門(mén)富集;并且GW9662拮抗劑可以阻礙Cy3G發(fā)揮降低藍(lán)藻菌群的作用，同時(shí)顯著下調(diào)AD小鼠中乳酸桿菌的相對(duì)豐度。此外，Cy3G可有效改善AD小鼠小腸粘膜上皮吸收細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的異常，而GW9662拮抗劑并不影響Cy3G對(duì)小腸粘膜保護(hù)作用的發(fā)揮。但是，在免疫調(diào)節(jié)方面，Cy3G可降低正常野生型小鼠血清中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)

13、和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）兩種細(xì)胞因子水平，但對(duì)AD小鼠影響不大。
　　結(jié)論：Cy3G可能是通過(guò)活化PPARγ緩解Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷;Cy3G還可部分改善AD小鼠認(rèn)知障礙及腦糖代謝異常，并部分逆轉(zhuǎn)由AD造成的小鼠腸道菌群比例失調(diào)所致的腸道微生態(tài)紊亂，保護(hù)腸粘膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)。因此，Cy3G具有調(diào)節(jié)胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)的作用，可用于預(yù)防