SF-1甲基化異常在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中的作用及其機制的初步研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率居高不下，且病死率呈上升趨勢。子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是內(nèi)外多種因素相互作用的結(jié)果，長期雌激素刺激是其主要危險因素。研究表明，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展中存在DNA甲基化異常，低甲基化是腫瘤發(fā)生過程中的早期的表觀遺傳學改變。
　　SF-1基因是雌激素生物合成重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活膽固醇遷移和類固醇生成所涉及的基因表達，在類固醇激素的生物合成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。那么SF-1基因

2、是否在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用并受到甲基化調(diào)控？這種作用又是通過何種分子機制來實現(xiàn)的？
　　因此本研究首先在組織水平檢測子宮內(nèi)膜癌SF-1表達及其基因啟動子甲基化狀態(tài)；然后通過細胞學實驗，探討SF-1基因甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌生物學行為的影響及其分子機制，將從新的分子靶點探尋子宮內(nèi)膜癌的生物學標志物，為子宮內(nèi)膜癌的有效診治策略提供可借鑒的實驗依據(jù)。
　　第一部分子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動子甲基化狀態(tài)及其臨床意義

3、r>　　目的:
　　檢測子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織和正常子宮內(nèi)膜組織中SF-1蛋白和甲基化相關(guān)蛋白DNMTs的表達以及SF-1基因啟動子的甲基化狀態(tài)，探討子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.采用免疫組織化學方法，檢測正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白的表達情況。
　　2.采用western blot方法，檢測正常子宮內(nèi)膜組織、子宮

4、內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1蛋白和DNMTs蛋白的表達水平。
　　3.分析子宮內(nèi)膜癌組織中，SF-1蛋白表達水平與臨床病理特征的關(guān)系。
　　4.采用BSP方法，檢測子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中SF-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1. IHC顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中SF-1蛋白表達明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；且同一病例中子宮內(nèi)膜癌組織 SF-1表達顯著高于子宮內(nèi)膜癌旁組織，差異具

5、有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。
　　2. WB結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌組織中，SF-1蛋白呈高表達，和癌旁組織比較，差異有顯著性（P<0.05），和正常內(nèi)膜組織比較，差異有極顯著性（P<0.01）。甲基化相關(guān)蛋白DNMT3a和DNMT3b在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達明顯低于子宮內(nèi)膜癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3．在不同病理類型、不同病理分級的子宮內(nèi)膜癌中，SF-1蛋白的表達水平不同，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.

6、05）。腫瘤組織病理分級越高，其 SF-1表達水平越高；特殊類型子宮內(nèi)膜癌中 SF-1表達明顯高于子宮內(nèi)膜樣腺癌。
　　4. BSP結(jié)果顯示，甲基化胞嘧啶百分比在子宮內(nèi)膜癌組織（8.2％）明顯低于癌旁組織（40.9%），差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明SF-1基因啟動子在子宮內(nèi)膜癌組織呈低甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)論:
　　1. SF-1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起促進作用，其異常高表達與患者的不良預(yù)后有關(guān)。

7、r>　　2. SF-1基因啟動子區(qū)的異常低甲基化可能是其蛋白表達水平升高的原因，SF-1基因啟動子低甲基化狀態(tài)在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子機制中可能起著重要的作用。
　　第二部分 SF-1基因啟動子甲基化異常對子宮內(nèi)膜癌細胞生長的影響
　　目的:
　　利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-2′-deoxycytidine（5-Aza-CdR）處理子宮內(nèi)膜癌細胞后，使 SF-1去甲基化，研究 SF-1基因啟動子甲基化異常對

8、子宮內(nèi)膜癌細胞SF-1表達及生物學行為的影響。
　　方法:
　　1.以子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1-A，RL95-2為研究對象，分別加以不同濃度的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR，每種細胞系分成不同濃度的5-Aza-CdR組和未經(jīng)任何處理的對照組。
　　2.采用EdU熒光標記法測定不同濃度5-Aza-CdR組處理后的細胞增殖情況。
　　3. Western blot方法檢測不同濃度5-Aza-CdR組和對照組細胞

9、中SF-1表達的差異。
　　4. BSP法檢測5-Aza-CdR處理后細胞SF-1基因啟動子甲基化水平。
　　5.采用qPCR法檢測5-Aza-CdR處理細胞后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達。
　　6.通過流式細胞儀檢測5-Aza-CdR組和對照組細胞凋亡的情況，以及采用Western blot方法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和細胞周期蛋白Cyc

10、lin D3的表達。
　　結(jié)果:
　　1.根據(jù) EdU檢測細胞增殖結(jié)果，低濃度5-Aza-CdR對子宮內(nèi)膜癌細胞有促進增殖作用，高濃度5-Aza-CdR對細胞產(chǎn)生毒性，抑制細胞增殖（P<0.05）。
　　2. Western blot結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌細胞株HEC-1-A和RL95-2中，SF-1蛋白呈一定水平的表達，經(jīng)過5-Aza-CdR處理后兩種細胞株均表現(xiàn)為SF-1表達升高，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P

11、<0.05）。
　　3. BSP測序結(jié)果顯示，低濃度5-Aza-CdR明顯降低SF-1基因啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平（P<0.05）。
　　4.通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，5-Aza-CdR處理后SF-1下游靶基因StAR, HSD3β2和CYP19A1 mRNA的表達明顯增高（P<0.05）。
　　5.流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示：與對照組相比，低濃度5-Aza-CdR組細胞凋亡明顯減少，高濃度5-Aza-Cd

12、R組細胞凋亡明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6.細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達檢測發(fā)現(xiàn)，1.0 uM5-Aza-CdR處理后細胞Bcl-2表達明顯增加，Bcl-2/Bax比值增加，或Caspase-3表達明顯降低（P<0.05）；5.0 uM5-Aza-CdR處理后Bax表達極顯著升高（P<0.01），或Bcl-2表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值下降， Caspase-3表達明顯

13、升高（P<0.05）。
　　7.細胞周期蛋白 Cyclin D3的表達檢測顯示，1.0 uM和2.5 uM的5-Aza-CdR作用后，細胞HEC-1-A和RL95-2中Cyclin D3的表達均明顯增加（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.通過5-Aza-CdR抑制SF-1基因啟動子甲基化水平后，能促進子宮內(nèi)膜癌細胞SF-1表達，說明子宮內(nèi)膜癌細胞SF-1高表達與SF-1基因啟動子區(qū)去甲基化有關(guān)。
　　2. S